Тайны вирусов

...тысячи лет идет эта тихая невидимая война человека и вирусов...

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

ТРАНСПЛАНТАТ ОТТОРГАЕТ ХОЗЯИНА

Случается, что не хозяин-реципиент "изгоняет" трансплантат, а происходит обратный процесс. Впервые, по-видимому, с этим явлением встретились Медавар с сотрудниками в опытах воспроизведения толерантности у эмбрионов. В их экспериментах, как мы помним, большая часть животных погибала или до рождения, или после него. Медавар отнесся к этому явлению только как к досадной неудаче и не попытался проанализировать ее причины. Потом он сожалел об этом: явление, известное под названием "реакция - трансплантат против хозяина" (РТПХ), было открыто другими...

В 1957 году датский ученый Мортен Симонсен, инъецировавший кровь взрослой курицы в вену куриного зародыша, обнаружил, что в селезенке у него образуются белые очажки. Если же донор и реципиент относились к одной чистой линии, то их не появлялось. Исследователь предположил, что очажки возникают в результате реакции попавших с кровью лимфоидных клеток на антигены реципиента. К такому выводу он уже был подготовлен психологически, так как еще в 1953 году, обнаружив в аллотрансплантатах почек у собак плазматические клетки, начал думать, что они способны реагировать против хозяина.

Позднее Биллингэм и Брент обнаружили, что при введении клеток селезенки взрослых мышей новорожденным реципиентам другой мыши у последних развивается заболевание, характеризующееся резкой задержкой роста и веса, которое может привести к гибели. После работ Симонсена стало ясно, что это явление - результат РТПХ.

Последующие исследования показали, что РТПХ развивается в следующих условиях: содержание иммунологически активных донорских клеток в трансплантате; наличие в теле реципиента антигенов, отсутствующих в донорских клетках; резко сниженная или вовсе отсутствующая иммунологическая реактивность реципиента в отношении донорских клеток.

С чем же связано сильное снижение иммунологической реактивности реципиента?

Оно может наблюдаться прежде всего в случае, если реципиентом является эмбрион или новорожденный с еще не зрелой иммунной системой. Иммунологическая беззащитность бывает также связана с угнетением реакции на любые антигены в результате общего рентгеновского или гамма-облучения либо введения как химических, так и биологических иммунодепрессоров. Наконец, такое явление может наблюдаться при наличии у реципиента специфической ареактивности по отношению к донорским клеткам, приобретенного или врожденного характера. Генетическая толерантность отмечается при трансплантации лимфоидных клеток родительских линий гибридам первого поколения (подробнее это было описано в главе III). Эта экспериментальная модель широко применяется для изучения РТПХ.

Постепенно исследователи пришли к убеждению, что РТПХ имеет очень большое теоретическое и практическое значение. В сущности, учение о РТПХ возникло тогда, когда для этого появились соответствующие предпосылки, иначе говоря, когда в эксперименте и клинике стали широко производиться пересадки лимфоидной ткани и костного мозга.

Поначалу основные усилия направлялись на изыскание способов предупреждения РТПХ и лечение вызванной ею трансплантационной болезни. Были предложены самые разнообразные методы: введение химических и биологических иммунодепрессоров, снижение иммунологической активности донорских клеток, а также отбор максимально совместимых доноров. Все они пока далеки от совершенства, но в значительной части случаев помогают спасти реципиентов.

Особенно большое практическое значение РТПХ имеет при лечении лучевой болезни. Как говорилось, еще в начале 50-х годов было установлено, что трансплантация костного мозга после облучения в смертельной дозе может предотвратить гибель животных от лучевой болезни: разрушаются прежде всего костный мозг и лимфоидная ткань, и вследствие этого иммунная система практически не функционирует и не может отторгнуть введенный чужеродный костный мозг. В таких условиях клетки трансплантированного костного мозга легко размножаются и могут полностью заместить костный мозг реципиентов.

Химерами в древнегреческой мифологии называли чудовищ, имеющих львиную голову, хвост дракона и туловище козы. Однако поскольку такие существа встречались только в сказках, слово "химера" приобрело и второе значение: словом этим стали обозначать несбыточную мечту. Но как мы видим на практике, вооруженные знаниями ученые помогают осуществить то, что казалось плодом необузданной фантазии. Так возникли радиохимеры - организмы, в которых после облучения и пересадки кроветворной ткани функционируют чужеродные донорские клетки.

При помощи различных методов удается получить полные радиохимеры, то есть животных, у которых функционирует только костный мозг донора. Неполные химеры - это существа, в которых содержатся клетки и донора и реципиента. А так как костный мозг родоначальник всех клеток крови и иммунной системы, то это значит, что у полных химер все эритроциты и лейкоциты, вся лимфоидная ткань, то есть иммунная система, донорские, а остальные ткани и органы - собственно реципиентские.

Например, если смертельно облученным мышам линии А ввести в вену костный мозг мышей линии В, то у реципиентов все клетки крови и вся иммунная система происходят из клеток мышей В. Эти аллогенные химеры будут отторгать трансплантаты кожи от мышей линии А, тогда как трансплантаты кожи мышей В у них стойко выживают.

Были получены не только аллогенные, но и ксеногенные химеры. Оказалось, что наилучшие результаты достигаются при ксенотрансплантации кроветворной ткани от животных близкородственных видов. В большинстве подобных экспериментов в качестве хозяев были взяты облученные мыши, в качестве доноров - необлученные крысы.

Полная радиохимера мышь-крыса внешне выглядит как типичная мышь. Однако не верьте ее внешнему виду: в иммунологическом отношении она не мышь, а крыса. У нее отторгаются трансплантаты сингенной мышиной кожи, по не происходит этого с трансплантатами кожи крыс - доноров костного мозга. Один автор так охарактеризовал результаты подобных опытов: мышь окрысилась в буквальном, а не в переносном смысле слова.

При введении чужеродной кроветворной ткани в организме облученных реципиентов происходит специфическое изменение иммунобиологических свойств хозяина, что проявляется в развитии иммунологической толерантности к трансплантатам костного мозга, взятым от донора.

Первая пересадка костного мозга человеку была осуществлена в 1958 году в Югославии. В результате аварии атомного реактора было облучено шесть человек, причем пять из них - абсолютной дозой нейтронного и гамма-облучения (от 600 до 1200 рентген). Пострадавшие были отправлены на самолете в Париж в клинику Мате, где им произвели вливание аллогенного костного мозга. У четверых больных отмечалось длительное приживление введенных клеток.

Однако трансплантация костного мозга предотвращает смертельные исходы от лучевой болезни только в течение первых 30-60 суток после облучения...

Через 1-4 месяца после трансплантации у значительной части реципиентов развивается так называемая вторичная болезнь, которая может привести к гибели. Это заболевание возникает чаще всего в результате РТПХ: введенные клетки, после того как они размножились в достаточном количестве и привели к формированию иммунной системы донорского типа, начинают распознавать чужеродные антигены хозяина и "выступать" против них. Следовательно, РТПХ - основная причина неудачных исходов при лечении лучевой болезни трансплантацией костного мозга, равно как и при пересадках костного мозга и тимуса детям, страдающим болезнями иммунологической недостаточности.

Огромное практическое значение пересадок костного мозга определяется тем, что их приходится производить по поводу лучевой терапии злокачественных опухолей, особенно при белокровии. Отчетливый терапевтический эффект при этом заболевании наблюдается только при облучении смертельными дозами ионизирующих излучений и поэтому больных приходится затем спасать от лучевой болезни путем трансплантации костного мозга. В третьей главе уже рассказывалось о пациенте клиники Мате, которому пересадили костный мозг, предварительно облучив в сверхсмертельной дозе. По существу, это был первый человек-радиохимера: его костный мозг был полностью замещен костным мозгом донора, что сопровождалось формированием иммунологической толерантности к трансплантатам его кожи.

Трансплантация костного мозга применяется также для лечения апластической анемии, при которой резко нарушены функции костного мозга. При этом заболевании пересадка костного мозга приводит к восстановлению нарушенных функций у 50% больных, а у людей молодого возраста - в 70% случаев. Пересадка костного мозга является сейчас основным методом при лечении апластической анемии. Однако даже если донор и реципиент идентичны по антигенам главного комплекса тканевой совместимости, примерно у 50% реципиентов развивается РТПХ и 25% больных погибает от этого.

По состоянию на август 1982 года в 26 центрах США, где производили трансплантацию костного мозга, из 174 больных, которым пересаживали костный мозг по поводу апластической анемии, в течение года выжило 44% больных. В Европе (159 больных) выживаемость в течение года при этих же условиях составляла 41 %.

При остром лейкозе костный мозг пересаживали только в том случае, если все другие способы лечения были безуспешны. Из первых 100 реципиентов в США по состоянию на август 1982 года 13% жили без обострений от 7 до 12 лет.

Большое значение имеет пересадка костного мозга при лечении так называемых тяжелых комбинированных иммунодефицитов (ТКИД) - врожденном заболевании, при котором нарушено созревание Т- и Б-лимфоцитов. У этих больных трансплантация костного мозга в части случаев приводит к длительному восстановлению функций иммунной системы. Так, например, в одной клинике у 8 из 9 больных, которым произвели трансплантацию совместимого костного мозга, развивалась РТПХ, причем шестеро погибли от инфекций, связанных с РТПХ, но трое выжили, и у них полностью восстановились иммунологические функции. Значит, трансплантация костного мозга уже сейчас позволяет спасти некоторых больных, которые б противном случае погибли бы в раннем детском возрасте.

Мы видим, что основным препятствием для лечения всех этих заболеваний является РТПХ - острая (быстропротекающая) или замедленная. Основная причина острой РТПХ - наличие в человеческом костном мозге, в отличие от мышиного, значительного количества Т-лимфоцитов. Предполагается, что замедленная РТПХ возникает в результате действия тех Т-лимфоцитов, которые возникают из донорских стволовых кроветворных клеток в течение нескольких недель после трансплантации при условии функционирующего тимуса. При лечении ТКИД обычно развивается острая РТПХ, так как функция тимуса при этом заболевании резко подавлена.

Какие же методы предложены для предотвращения РТПХ?

Наибольшее количество экспериментов с этой целью было поставлено на мышах, и проблема предотвращения у них РТПХ практически решена. С этой целью применяются различные методы: уменьшение количества Т-лимфоцитов в трансплантируемом костном мозге, замена костного мозга эмбриональной печенью, которая также содержит стволовые кроветворные клетки. Ряд эффективных методов предотвращения РТПХ. у мышей был предложен в руководимой автором лаборатории. Сложность, однако, заключается в том, Что у этих грызунов толерантность к антигенам хозяина развивается значительно легче, чем у других видов животных и особенно у людей.

Наибольшее практическое значение для предотвращения РТПХ имеет предварительное введение реципиентам различных химиотерапевтических препаратов (например, циклофосфамида, метатрексата), а также обработка донорского костного мозга антителами (в том числе моноклональными), разрушающими его Т-лимфоциты.

Мы видим, какое значение имеет изучение радиохимер для практики медицины. Но не меньшее значение это представляет и для решения многих фундаментальных теоретических проблем. Радиохимеры оказались удивительной экспериментальной моделью, которая помогла ученым ответить на многие вопросы. Вместе с тем само их существование заставило ученых задуматься над некоторыми проблемами, которые ранее не были в поле зрения.

Одна из них заключается в следующем: нельзя ли их использовать для генной терапии (пересадки генов) наследственных болезней человека? Нельзя ли получить гибрид генетической и иммунологической инженерии?

Радиохимеры и проблема пересадки генов при наследственных заболеваниях. Существует недуг, называемый талассемией, или средиземноморской болезнью. У больных нарушен синтез гемоглобина. Красные кровяные шарики, содержащие патологический гемоглобин, нежизнеспособны, легко разрушаются - человек погибает от малокровия. Болезнь наследственна и неизлечима.

И вот в апреле 1981 года журнал "Сайенс", сообщил, что двое ученых из Калифорнийского университета М. Клайн и У. Солсер предприняли попытку вылечить талассемию путем пересадки гена бетаглобина, контролирующего синтез гемоглобиновых цепочек.

Все это хорошо,- может спросить недоумевающий читатель,- но при чем здесь радиохимеры?

Оказывается, однако, что радиохимеры имеют к этой истории самое непосредственное отношение.

3 апреля 1980 года М. Клайн с сотрудниками опубликовал в журнале "Нейчур" статью, которая вызвала живой интерес ученых. И не удивительно: в ней была сделана первая попытка объединить достижения генной и иммунологической инженерии.

Ученый решил клонировать ген, определяющий устойчивость к метатрексату (противоопухолевому препарату) в клетках костного мозга, введенных облученным мышам. Метатрексат обладает способностью разрушать не только раковые, но и быстроделящиеся клетки костного мозга. Если его инъецировать радиохимерам, в организме которых размножаются клетки костного мозга, содержащие гены устойчивости к препарату (точнее, гены, контролирующие синтез фермента, разрушающего его), то создаются селективные условия для размножения только тех из них, которые содержат этот ген. Остальные должны погибнуть.

Чтобы определить степень размножения донорских клеток в организме радиохимер, им вводили клетки костного мозга от сингенных мышей, содержащих хромосомную метку, отсутствующую в тканях реципиента. Перед трансплантацией клетки костного мозга обрабатывали в пробирке препаратами ДНК, содержащими гены устойчивости к метатрексату, смешивали с сингенными клетками костного мозга, в которых отсутствовал соответствующий ген, и вводили эту смесь внутривенно сингенным облученным мышам. В результате кроветворение у облученных реципиентов постепенно восстанавливалось.

В течение всего периода регенерации применяли метатрексат - чтобы вызвать относительное угнетение нетрансформированных стволовых клеток и обеспечить селективные условия для размножения клеток, содержащих соответствующий функционирующий ген. При этом авторы имели в виду, что из всех клеточных типов, имеющихся в костном мозге, только трансформация (изменение генотипа) соответствую щих стволовых клеток может привести к длительному размножению донорских клеточных элементов, устойчивых к испытываемому препарату. Мышам вводили дозы метатрек-сата, которые обеспечивали селекцию резистентных к нему кроветворных клеток и вместе с тем не вызывали гибели контрольных животных.

Между 30-м и 40-м днями после трансплантации в крови реципиентов выявлялось четкое увеличение числа донорских клеток. Костный мозг этих мышей пересаживали вторично облученным сингенным реципиентам, которым тоже вводили метатрексат, и у них также происходило увеличение числа клеток с хромосомным маркером.

У мышей, получавших трансформированные клетки и метатрексат, наблюдалось значительно более выраженное восстановление кроветворения, чем у контрольных, которым инъецировали метатрексат и обычные клетки костного мозга, не содержащие гены устойчивости к этому веществу.

Таким образом, была установлена возможность трансформации клеток костного мозга в результате введения гена устойчивости к метатрексату, а также клонирования этих генов в организме радиохимер.

Авторы подчеркивали возможность использования полученных ими данных в клинике. Например, перенос лекарственной устойчивости больным раком может способствовать формированию у них переносимости больших доз химиотерапевтических препаратов. Встраивание в хромосомы клеток костного мозга подобных генов вместе с другими генами приближает, по мнению этих ученых, перспективу лечения генетических болезней человека, например болезней, обусловленных повреждением или отсутствием генов, ответственных за синтез гемоглобина.

В 1980 году появилось сообщение, что Калифорнийский университет предполагает осуществить первую в мире пересадку гена у человека с целью излечения гомозиготной бета-талассемии. Копии этого гена предполагалось ввести в клетки костного мозга больного. Чтобы обеспечить этим трансформированным клеткам селективное преимущество для размножения, в клетки костного мозга собирались также поместить второй ген, полученный из человеческого вируса герпеса и контролирующий синтез фермента тимидин-киназы. Копии каждого гена предполагалось клонировать в бактериях, после чего их намеревались ввести в костный мозг больного и затем трансплантировать эти клетки больному обратно, предварительно подвергнув его умеренному облучению, чтобы облегчить их приживление. Ученые полагали, что в этом случае около 10 000 клеток должны были содержать оба гена, а чтобы больной получил необходимое количество нормального гемоглобина, достаточно обеспечить приживление и размножение только одной стволовой клетки костного мозга.

Многие ученые считали этот эксперимент преждевременным, так как к тому времени еще не было получено достаточно четких результатов на животных.

Первые опыты генной терапии у человека были поставлены на двух больных, находившихся в безнадежном состоянии. Однако в процессе лечения Клайн без разрешения соответствующих комитетов решил ввести одному из них гены не в чистом виде, как это предусматривалось протоколом, а в рекомбинатной форме, то есть вместе с так называемым вирусным вектором. Это серьезное нарушение не осталось безнаказанным: Клайну предложено было подать в отставку.

Объем книги не дает возможности ознакомить читателя с теми поистине безграничными и неожиданными перспективами, которые открылись перед разными областями биологии и медицины в связи с созданием радиохимер. Укажем только на возможность использовать их для культивирования различных клеток иммунной системы в организме, то есть ин виво, изучать как взаимодействие, так и происхождение тех или иных клеточных элементов, а также условия развития толерантности и РТПХ на клеточном уровне.

Задумаемся над логикой развития учения о радиохимерах. Первый шаг был сделан с чисто практической целью - найти методы лечения лучевой болезни. Затем выяснилось, что при трансплантации костного мозга облученным животным могут возникнуть радиохимеры. Дальнейшие исследования привели к открытию "реакции трансплантат против хозяина", что заставило ученых разработать методы предотвращения РТПХ, а также изучить механизмы ее возникновения и развития. Эти исследования позволили выяснить роль РТПХ в различных областях биологии и медицины. Затем оказалось, что трансплантация костного мозга в комбинации с облучением или без него является эффективным методом лечения различных болезней крови и тяжелых комбинированных иммунодефицитов. Одновременно было установлено, что в организме радиохимер можно выявлять закономерности формирования толерантности и иммунитета на клеточном уровне. Наконец, изучение этих удивительных организмов, созданных человеком, привело к совершенно неожиданному предположению: а нельзя ли их использовать для разработки методов генной терапии наследственных заболевании человека...

Какие еще тайны раскроются при их изучении? Какие еще загадки они позволят разгадать?

На эти вопросы ответит только будущее.