Тайны вирусов

...тысячи лет идет эта тихая невидимая война человека и вирусов...

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

БЕШЕНСТВО (дополнение к ст. "Бешенство", БМЭ, изд. II, т. 3).

БЕШЕНСТВО (дополнение к ст. "Бешенство", БМЭ, изд. II, т. 3).

Возбудитель, лабораторная диагностика, специфическая профилактика. Самым важным достижением в изучении бешенства за последние годы нужно считать выращивание его возбудителя в культуре ткани (in vitro), в отличие от применявшегося до сих пор метода культивирования в организме животных (in vivo). Новые данные по морфологии и физиологии вируса бешенства, взаимодействию вируса с восприимчивыми клетками, титрованию антигена и антител in vitro и, наконец, антирабической вакцине, свободной от балластных веществ, связаны гл. обр. с внедрением в практику лабораторных исследований методики культуры ткани.

Выращивание вируса бешенства в культуре ткани оказалось более трудной задачей, чем выращивание возбудителей других нейровирусных заболеваний. В наст. время можно говорить о размножении в культуре ткани лишь отдельных предварительно адаптированных штаммов уличного и фиксированного вирусов бешенства. При этом штаммы уличного вируса могут быть адаптированы к культуре ткани несколько легче и быстрее, чем штаммы фиксированного вируса. Прямыми серийными пассажами (заражение монослоя культуральным вирусом из предшествующего пассажа) штаммы уличного вируса адаптированы и успешно выращиваются в культуре первичных трипсинизированных клеток почки сирийского хомяка, почки новорожденных собак, слюнных желез собак, в культуре перевиваемых линий клеток эмбриона сирийского хомяка (ВНК-21 С13), эпендиомы мышей (ЕрО), эндотелия кролика.

Большое внимание было уделено адаптации штаммов фиксированного вируса бешенства к культуре ткани. Однако попытки прямой адаптации (заражение монослоя культуральным вирусом предшествующего пассажа) оказались безуспешными. Задача была решена применением чередующихся пассажей (мозг мыши - культура ткани- мозг мыши и т. д.) и смеси клеток (перевивка инфицированных клеток в смеси с нормальными трипсинизированными клетками). Штаммы фиксированного вируса бешенства (Paris, Pitman-Moore, Sad, CVS) успешно адаптированы и теперь хорошо размножаются в первично трипсинизированных клеточных культурах почки сирийского хомяка, почки новорожденных собак, лимф, узлов собак, слюнных желез новорожденных собак, в культуре перевиваемых линий клеток - почка эмбриона сирийского хомяка, ретикулоэндотелиома кролика, эпендиома мышей, легкие человека (диплоидные клетки, штамм WI-38). Штаммы фиксированного и уличного вирусов бешенства, предварительно адаптированные к клеткам почки сирийского хомяка, имеют более широкий спектр тканевой активности, они интенсивно размножаются в культуре первичных клеток почки эмбриона овцы, свиньи, морской свинки и перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (ПЭС, калифорнийский штамм), эмбриона человека (кожа, мышечная и почечная ткань: штаммы ЧЭ-1, ПЧЭ-1). Так наз. авианизированный штамм фиксированного вируса бешенства Флюри хорошо размножается в культуре первичных клеток куриного эмбриона и сирийского хомяка.

Вирус бешенства обычно вызывает в культуре ткани инфекцию хронического типа. После ряда серийных пассажей или при перевивках вируса методикой смеси клеток воспроизведена острая инфекция с цитопатогенным эффектом, вызываемым как уличным, так и фиксированным вирусом в культуре клеток сирийского хомяка, эпендиомы мышей, легких человека (штамм WI-38). Из-за регулярной невоспроизводимости феномен цитопатогенного действия еще не получил применения для титрования вируса и вируснейтрализующих антител. Пока остаются безуспешными попытки воспроизведения феномена бляшко-образования, гемагглютинации в культуре ткани, зараженной вирусом бешенства.

В культуре ткани вирус бешенства интерферирует со многими вирусами, содержащими как РНК, так и ДНК (вирус болезни Ньюкасла, западного лошадиного энцефаломиелита, везикулярного стоматита, ложного бешенства, осповакцины). Феномен интерференции успешно используется для титрования вируса бешенства и антител в культуре ткани. Механизм интерферирующего действия вируса бешенства остается неизученным.

В культуре почки сирийского хомяка, инфицированной вирусом бешенства, обнаружены цитоплазматические включения, сходные с тельцами Бабеша - Негри, от к-рых они отличаются гомогенной структурой и характерным светлым пояском, отделяющим их от цитоплазмы. Включения эти окрашиваются кислыми красками, содержат антиген вируса бешенства, выявляемый методом флюоресцирующих антител (МФА). При электронномикроскопическом изучении зрелые вирусные частицы (вирионы) вируса бешенства в них не обнаружены.

В связи с выращиванием вируса бешенства в культуре ткани оказалось возможным получение электронномикроскопических фотографий вируса. Под электронным микроскопом вирионы вируса бешенства имеют округлую форму или вид коротких палочек, напоминающих пулю, с одним прямоугольным и другим закругленным концом. Прослежено, что в начале инфекции вирусные частицы в виде бутонов обнаруживаются у внутренней оболочки цитоплазмы, а затем у наружной оболочки и отторгаются от нее в свободное экстрацеллюлярное пространство, подобно миксовирусам. Зрелые вирусные частицы имеют двойную оболочку и внутренний компонент спиральной структуры. Наружная оболочка, подобно миксовирусам, покрыта мелкими выступами в виде бахромы. Обнаружены также нитевидные образования с сегментированной структурой. Диаметр овальных вирионов варьирует от 80 до 120 мк, палочковидные вирионы имеют длину 120-300 мк и ширину 60-100 мк, нитевидные образования достигают длины 1900 мк. Считается, что в культуре ткани удлиненные вирусные частицы ассоциированы чаще всего с уличным вирусом бешенства, а короткие вирионы - с фиксированным вирусом. Опытами с применением антирабического гамма-глобулина, нагруженного ферритином, доказано; что описанные выше образования являются специфичными для вируса бешенства.

По морфологическим и биологическим свойствам вирус бешенства во многом сходен с миксовирусами. Он содержит РНК; 5-бромдезоксиуридин в культуре ткани не подавляет размножение вируса бешенства, но сильно тормозит размножение вирусов герпеса, псевдобешенства, аденовирусов, содержащих ДНК [Кисслинг, Риз (R. Kissling, D. Reese), 1963].

Из новых методов скоростной и экономичной (in vitro) индикации вируса бешенства или антирабических антител наиболее ценным является МФА. Для титрования антител используется непрямой МФА, а прямой МФА успешно применяется в лабораторной практике для индикации и титрования вируса бешенства, выращиваемого в культуре ткани. Прямой МФА имеет довольно широкое практическое применение для ускоренной диагностики бешенства человека и животных. Препараты-отпечатки готовят на предметных стеклах из кусочков аммонова рога, коры больших полушарий и мозжечка, сохранявшихся на холоде без каких-либо консервирующих жидкостей. Далее препараты фиксируют в холодном ацетоне при t° -20° в течение 4 час., просушивают при комнатной температуре и окрашивают антирабическим гамма-глобулином, конъюгированным флюоресцеинизотиоцианатом (1 мг флюорохрома на 100 мг сывороточного белка) во влажной камере при t° 37° в течение 20 мин. После двукратного промывания в буферном растворе препараты ополаскивают дистиллированной водой, просушивают. Под люминесцентным микроскопом в препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, обнаруживаются гранулы, включения округлой, овальной, неправильной формы величиной от 0,5 до 20 мк или тяжи, нити длиной до 15-60 мк с характерным сверкающим, ярким зеленовато-желтым свечением. При высокой концентрации иммунологически активного антигена все поле зрения может быть усеяно специфически светящимися образованиями.

Высокая специфичность и чувствительность МФА позволяет получать ответ за 4-6 часов. Однако в отдельных случаях результат МФА оказывался отрицательным, несмотря на положительные результаты биопробы, и наоборот. Обнаружение в исследуемом препарате включений с характерным свечением позволяет поставить диагноз бешенства. При отрицательном ответе рекомендуется поставить биопробу: интрацеребральное заражение молодых или новорожденных белых мышей с последующим исследованием их МФА. Биопроба на новорожденных белых мышах в сочетании с МФА позволяет поставить диагноз бешенства за 5-6 дней.

Для ускоренной диагностики бешенства предложена реакция диффузии в агаровом геле по Оухтерлоню (О. Ouchterlony). Она основана на иммунной преципитации при соединении антигена с антителами, диффундирующими навстречу друг другу через агаровый гель. В мозговой взвеси вируса бешенства обнаружены две фракции растворимого антигена, образующие две линии преципитации. Нормальная мозговая ткань с соответствующей гомологичной антисывороткой также вызывает образование двух линий преципитации.

С целью удаления антимозговых антител рекомендуется истощение сыворотки нормальной мозговой взвесью или получение иммунной сыворотки на яичную культуру вируса бешенства Флюри. Реакция преципитации в агаровом геле достаточно чувствительна только при высоком содержании антигена в исследуемом материале [Лепин (P. Lepine), 1966]. Реакция нуждается в усовершенствовании, чтобы быть использованной в широкой практике.

С целью предупреждения поствакцинных осложнений и снижения общей реактогенности антирабических прививок предложены новые типы антирабических вакцин. Основная задача их изготовления: сократить или полностью устранить содержание в вакцине балластной мозговой ткани. Поэтому в качестве источника вакцинного вируса используют взвесь мозга новорожденных животных, взвесь тканей утиного или куриного зародыша либо вируссодержащую культуральную жидкость.

Вакцины, приготовляемые из мозга новорожденных крыс и мышей, прошли нек-рое практическое испытание. В СССР эту вакцину изготовляют из мозга новорожденных крыс (Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов) по той же методике, что и феноловую вакцину типа Ферми (см. Антирабические вакцины, т. 2). Препарат лиофилизируется с желатино-сахарозным наполнителем. В Чили вакцину готовят из мозга новорожденных мышей и инактивируют ультрафиолетовыми лучами. В СССР при применении крысиной вакцины зарегистрированы как местные и общие кожно-сосудистые аллергические реакции, так и отдельные случаи неврологических осложнений различной тяжести. Выяснилось, что вакцина из мозга новорожденных животных не является безаллергенным препаратом.

Антирабическая вакцина из взвеси тканей утиного зародыша (штамм Pitman - Moore), инактивированная β-пропиолактоном, широко применяется в США для лечебно-профилактической иммунизации людей. Считается, что внедрение этой вакцины в практику позволило сократить частоту поствакцинальных- неврологических осложнений. Однако при применении утиной вакцины все же зарегистрированы отдельные случаи неврологических осложнений и значительно чаще местные и общие аллергические реакции, лимфоаденопатии, особенно у людей, чувствительных к яичному белку. Живая яичная антирабическая вакцина, приготовляемая из тканей куриного зародыша (штамм Флюри ХЕП), в нек-рых странах находит практическое применение для профилактической иммунизации отдельных групп населения (собаколовы, охотники, почтальоны, ветеринарные работники, сотрудники лаборатории по диагностике бешенства).

В стадии экспериментальной разработки находятся вакцины, приготовляемые на культуре ткани. Известны три типа культуральных антирабических вакцин, разрабатываемых для лечебно-профилактической иммунизации людей: вакцина, приготовляемая в культуре первичных клеток почки сирийского хомяка (штамм CVS), инактивированная формалином (Кисслинг, Риз, 1963); вакцина, приготовляемая в культуре диплоидных клеток человека [штамм Флюри ХЕП; Виктор, Копровский (Т. Wiktor, Н. Koprowski), 1965], и вакцина, приготовляемая на культуре первичных клеток почки сирийского хомяка, инактивированная фенолом (вакцинный штамм Sad) и лиофилизированная с желатино-сахарозным наполнителем (М. А. Селимов, Аксенова, 1965). Показано, что культуральная антирабическая вакцина может изготовляться серийно в больших объемах; в опытах на лабораторных животных она обладает такой же иммуногенной и антигенной активностью, как образцы стандартной мозговой вакцины. В зарубежной литературе еще нет данных об испытании культуральной антирабической вакцины у человека. В Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР при испытании культуральной антирабической вакцины в опыте на добровольцах отмечены низкая реактогенность и высокая антигенная активность препарата.