Тайны вирусов

...тысячи лет идет эта тихая невидимая война человека и вирусов...

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

ВИРУСЫ (дополнение к ст. "Вирусы", БМЭ, изд. II, т. 5).

ВИРУСЫ (дополнение к ст. "Вирусы", БМЭ, изд. II, т. 5).

Строение вирусов.

Исследованиями последних лет, проведенными с применением методов негативного контрастирования в электронном микроскопе и рентгеноструктурного анализа, были получены новые данные о строении В., обобщенные в работах Каспара и Клага (D. Caspar, A. Klug, 1962), Хорна и Уайлди (R. W. Horne, P. Wildy, 1963); новая терминология введена Львовым (A. Lwoft, 1962).

В соответствии с этими данными единицей, или индивидуумом, зрелого вируса является вирион. Генетическим материалом вириона является одна молекула ДНК пли РНК, мол. масса (мол. вес) к-рой колеблется в широких пределах у разных вирусов: от 500 ООО дальтонов (что соответствует 1600 нуклеотидам) до 150 000 000 дальтонов (что соответствует величине генома мелких бактерий - микоплазм). Молекула нуклеиновой к-ты защищена белковым футляром, состоящим из большого числа однотипных молекул или их агрегатов. Молекулы белка, из к-рых состоит футляр, называются структурными единицами, или капсидами, а их агрегаты - морфологическими единицами, или капсомерами; последние могут состоять из немногих структурных единиц или даже одной такой единицы. Форма капсомеров может быть разнообразной: шарообразная, овоидная, палочкообразная, трубчатая.

Периодическое строение белкового футляра вируса было предсказано Криком и Уотсоном (F. Н. Crick, J. D. Watson, 1957) на том основании, что нуклеиновая к-та вируса может кодировать небольшое число белков, как это вытекает из соотношения в генетическом коде числа нуклеотидов к числу аминокислот 3:1. Поскольку белковый футляр вируса состоит из одинаковых молекул или их агрегатов, укладка их вокруг молекулы нуклеиновой к-ты не произвольна, а создает геометрически правильные фигуры: только в этом случае образуется тело, имеющее наименьший уровень свободной энергии. Образование та кого тела происходит вследствие взаимодействия молекулярных сил и подчиняется законам статической механики, будучи сходно с явлениями кристаллизации и полимеризации. При этом происходят самопроверка и исправление ошибок синтеза: если структурная единица белкового футляра синтезирована неправильно и отличается от остальных структурных единиц, она не может войти в состав образующегося биол. полимера и мешает образованию последнего. Самосборка белковых субъединиц может произойти и в отсутствие нуклеиновой к-ты, однако в ее присутствии образуется более прочная структура, т. к. в этом случае имеют место межмолекулярные взаимодействия не только между белковыми компонентами, но и между последними и молекулой нуклеиновой к-ты.

Известны два типа построения белковых футляров вирусов, отличающихся по типам симметрии: спиральный и кубический. При спиральном, или винтовом, типе симметрии белковые молекулы укладываются вокруг молекулы нуклеиновой к-ты так что образуют цилиндрическое тело с винтовой поверхностью (рис. 1). Для характеристики вирионов в этом случае измеряют такие параметры, как форма и размер структурных единиц (белковых молекул), наружный и внутренний диаметры цилиндра, число молекул на один виток, угол винта и его шаг. По спиральному типу построены вирионы табачной мозаики и многих других вирусов, поражающих растения. Палочки могут быть гибкими или ригидными. По этому же типу построен внутренний компонент (нуклеокапсид) вируса гриппа и других миксовирусов.

Рис. 1. Вирион табачной мозаики (схема укладки белковых молекул вокруг его РНК).

Рис. 1. Вирион табачной мозаики (схема укладки белковых молекул вокруг его РНК).

При кубическом типе симметрии нуклеиновая к-та свернута в клубок, и структурные единицы образуют вокруг нее многогранное тело, приближающееся по форме к шару. Такой фигурой у известных в наст. время вирусов является икосаэдр с осями симметрии 5:3:2. Число капсомеров у вируса с кубическим типом симметрии строго определенно, зависит от их размеров и определяется формулой 10 х (n-I)2+2, где х=1 или 3, а n больше 2. Типичным примером вирионов подобного типа являются вирионы полиомы или аденовируса (рис. 2). Так, напр., вирионы полиомы имеют диаметр 550 А, состоят из 42 капсомеров, каждый из к-рых имеет диаметр 80 А и отделен от другого расстоянием 40 А. По этому же типу построены вирионы аденовирусов, энтеровирусов, многих вирусов растений, а также нуклеокапсиды вируса герпеса.

Рис. 2. Вирионы аденовируса. Негативно контрастированный препарат (слева) и модель (справа).

Рис. 2. Вирионы аденовируса. Негативно контрастированный препарат (слева) и модель (справа).

Рис. 3. Вирионы гриппа, частично разрушенные. Видно строение нуклеокапсида и внешней оболочки.

Рис. 3. Вирионы гриппа, частично разрушенные. Видно строение нуклеокапсида и внешней оболочки.

Многие из упомянутых выше вирусов представляют собой голые нуклеокапсиды, т. е. состоят из нуклеиновой к-ты и белкового футляра со спиральным или кубическим типом симметрии. Однако ряд вирусов, помимо нуклеокапсида, имеет также внешние оболочки, в состав к-рых входят белки, липиды и углеводы. Так, напр., миксовирусы (вирус гриппа) и парамиксовирусы (парагриппозные вирусы, вирус ложной чумы кур, кори, паротита) имеют нуклеокапсид со спиральным типом симметрии, к-рый свернут в спираль или клубок и окружен оболочкой (суперкапсидом), также имеющей периодическую структуру (рис. 3).

Рис. 4. Вирионы оспы: 1 - наружный вид; 2 - вид сверху; 3 - вид сбоку.

Рис. 4. Вирионы оспы: 1 - наружный вид; 2 - вид сверху; 3 - вид сбоку.

Вирион герпеса представляет собой нуклеокапсид, построенный по кубическом у [типу симметрии и окруженный двумя внешними оболочками.

Нек-рые вирусы имеют более сложное строение. Так, вирусы оспы имеют плотный нуклеоид, состоящий из нитеобразных структур (ДНК, белок) и окруженный несколькими оболочками; между ними и нуклеоидом помещаются боковые тела; внешняя оболочка состоит из сложно уложенных трубчатых структур (рис. 4). Другим примером сложно устроенных вирусов являются Т-четные фаги (см. Бактериофаг, т. 3).

При изучении репродукции вирусов были обнаружены различные аномалии их строения. Так, напр., у вирусов гриппа и герпеса встречаются вирионы, частично или полностью лишенные внутреннего содержимого - нуклеоида. У миксовирусов наряду с круглыми вирионами обнаружены нитеобразные и неправильной формы частицы, у вирусов полиомы - продолговатые частицы, у т-четных фагов - формы с несколькими отростками, вирионы с аномальным строением нуклеокапсида (вирус Сендаи).

В. Жданов.

Репродукция миксовирусов.

Первоначальная стадия взаимодействия миксовирусов с чувствительными к ним клетками, начинающаяся адсорбцией вирусов на поверхности клеток и завершающаяся освобождением миксовирусной РНК от белковых оболочек, изучена достаточно подробно благодаря исследованиям Готтшалька (A. Gottschalk, 1959), В. М. Жданова и А. Г. Букринской (1961), Дейлса и Чоппина (S. Dales, P. W. Choppin, 1962), Хойла (L. Hoyle, 1962), В. М. Жданова и Г. А. Смирновой (1965). Адсорбция миксовирусов на поверхности клеток является физ.-хим. процессом и происходит в результате электростатического взаимодействия между поверхностными структурами внешней оболочки вирусов (гемагглютининов) и мукопротеидными участками клеточной мембраны. При этом нейраминидаза вирусов отщепляет нейраминовую к-ту мукопротеидов, значение к-рой станет ясным, если учесть, что она несет 87% от- рицательных зарядов поверхности клетки.

Парамиксовирусы имеют также другой фермент - лецитиназу, к-рый разрушает липопротеиды клеточной мембраны, с чем связаны явления гемолиза и симпластообразования, наблюдаемые при обработке клеток большими дозами этих вирусов. Предполагается, что эти "входные" ферменты - нейраминидаза и лецитиназа,- разрыхляя клеточную мембрану, облегчают проникновение миксовирусов в клетки.

Проникновение вирионов происходит посредством виропексиса - механизма, напоминающего фагоцитоз. В месте соприкосновения вириона с клеточной мембраной последняя образует впячивание, превращающееся затем в вакуоль, и вирусная частица оказывается втянутой внутрь клетки. Здесь происходит разрушение белковых оболочек вириона, к-рое, однако, начинается ранее, в момент адсорбции вирусов на поверхности клетки. Процесс этот имеет двоякую природу: с одной стороны, происходит перераспределение липидов, входящих в состав как вирионов, так и клетки, с другой - ферментативное расщепление протеиназами клетки белков, составляющих внешнюю оболочку вирионов. В результате освобождается вирусная РНК, к-рая становится функционально активной.

Репликации миксовирусной РНК и синтезу структурных белков (растворимого S-антигена и гемагглютинина) предшествуют ранние вирус-индуцированные синтезы. Существует, по-видимому, несколько "ранних" функциональных белков, синтезируемых на этой стадии. Одним из них является миксовирусная РНК-полимера-за, отсутствующая в нормальных, неинфицированных клетках. Необходимость синтеза этого вирусспецифического фермента доказывается опытами с обработкой клеток ингибиторами белкового синтеза - парафторфенилаланином (ФФА) ц пуромицином [Шольтиссек и Ротт (С. Scholtissek, R. Rott), 1963; А. Г. Букринская и др., 1965]. В этих опытах обработка клеток ФФА и пуромицином предупреждала синтез вирусной РНК и образование инфекционного вируса, в то время как обработка клеток актиномицином D - ингибитором синтеза клеточной ДНК-зависимой РНК не препятствовала синтезу вирусной РНК и формированию инфекционного вируса у большинства миксовирусов, за исключением вируса гриппа, к-рые чувствительны к большим дозам этого антибиотика.

Весьма вероятно, что в этой фазе образуются еще два функциональных вирусных белка, один из к-рых является репрессором синтеза клеточной ДНК-зависимой РНК, а другой - репрессором синтеза клеточного белка. Существование первого из них доказывается в опытах с малой множественностью инфекции авторадио-графически и путем определения синтеза РНК на основании включения меченных по углероду предшественников. В этих опытах удается обнаружить снижение синтеза клеточной РНК в первые часы миксовирусной инфекции. Предположение о существовании репрессора синтеза белка основывается на косвенных данных: в клетках, инфицированных миксовирусами. в первые часы удается обнаружить угнетение синтеза белка, к-рое наступает даже раньше, нежели угнетение синтеза РНК. поэтому оно вряд ли может быть вторичным, РНК-зависимым.

Возможна и другая интерпретация этих фактов: угнетение синтеза клеточных РНК и белков может быть вызвано продуктами распада белковых оболочек миксовирусов.

Репликация миксовирусной РНК, по-видимому, происходит в два этапа: сначала синтезируется репликативная двухнитчатая или циркулярная форма РНК, а затем на ее комплементарной минус-нити синтезируются инфекционные плюс-нити миксовирусной РНК. В пользу этого предположения свидетельствуют опыты с высокой множественностью инфекции, в к-рых удается обнаружить два пика ускоренного синтеза РНК: первый из них имеет максимум через 1 час после заражения клеток миксовирусами, второй - через 4-5 часов, причем оба пика не чувствительны к актиномицину D (А. Г. Букринская. А. К. Гительман и В. М. Жданов, 1966). В то время как второй пик синтеза РНК чувствителен к пуромицину и, по-видимому, обеспечивается вирусной РНК-полимеразой, первый пик не чувствителен к этому антибиотику и, следовательно, обеспечивается предсуществующими в клетке ферментными системами, скорее всего клеточной РНК-полимеразой.

Т. о., предполагаемая схема репликации миксовирусной РНК имеет два этапа.

После освобождения от белковых оболочек родительской РНК клеточные ферменты (РНК-полимераза) синтезируют на ней комплементарную нить РНК, образуя таким путем репликативную форму миксовирусной РНК (двухнитчатую или циркулярную). В этот же период синтезируется вирусспецифическая РН К-полимераза, к-рая синтезирует на комплементарной нити репликативной РНК дочерние нити инфекционной миксовирусной РНК.

Неясным остается до сих пор вопрос о механизме кодирования белков миксовирусов. На модели мелких РНК-содержащих вирусов было показано, что их РНК выполняет непосредственно информационные функции, объединяясь с рибосомами. Это положение обычно распространяют на все РНК-содержащие вирусы. Возможно, однако, и альтернативное толкование имеющихся фактов, допускающее существование информационной РНК у миксовирусов.

Топография синтеза структурных белков у миксовирусов изучена путем применения методов иммунофлюоресценции и маркировки ртутью и йодом, делающих контрастными при электронной микроскопии комплексы антиген - антитело. При помощи этих методов было показано, что белок S-антигена у вируса Сендаи синтезируется в ядрышках, у вирусов гриппа - в ядрах, а у вирусов ложной чумы кур - в цитоплазме. Гемагглютинин у всех миксовирусов синтезируется в цитоплазме (В. М. Жданов и С. Я. Гайдамович, 1966). Из мест своего синтеза рибонуклеопротеид (S-антиген) и гемагглютинин транспортируются к периферической зоне цитоплазмы, где происходит формирование вирионов. При этом в состав зрелого вируса включаются липиды и белки клетки хозяина. Значение липидов состоит, по-видимому, в том, что ови цементируют белковые компоненты миксовирусов, придавая им, в частности S-антигену, определенную конфигурацию [Кейтс (М. Kates) и др., 1964]. Что же касается белковых компонентов клеток, поражаемых вирусов, то их значение остается неясным. В составе вирионов миксовирусов обнаружены антиген Форсмана, антигены групп крови, видовоспецифические антигены клеток (П. Н. Косяков и 3. И. Ровнова, 1965), а у нек-рых миксовирусов также ферменты клеток - упоминавшаяся уже лецитиназа (гемолизин) и аденозинтрифосфатаза.

Формирование вирионов происходит при участии клеток; вирионы выходят из клеток, как бы отпочковываясь и захватывая участок модифицированной клеточной мембраны, имеющей антигенную структуру внешней оболочки миксовируса. Имеются попытки толковать этот процесс как извращение нормального хода синтеза и формирования нормальных клеточных структур типа микроворсинок под влиянием генетической информации, вносимой в клетку миксовирусами [Маркус (P. J. Marcus), 1962]. В процессе репродукции, особенно в поздних ее стадиях, миксовирусы вызывают разнообразные цитопатические эффекты: образование цитоплазматических включений, многоядерных клеток и симпластов, дегенеративные и деструктивные процессы.

В. Жданов.

Изотопы в вирусологических исследованиях.

Метод радиоактивных изотопов в вирусологии расширяет возможность изучения тонких интимных процессов при взаимодействии вируса с клеткой. Для метки биол. структур обычно применяют углерод (С14), тритий (Н3), фосфор P32), серу (S35) и йод (J131). Можно метить непосредственно вирус с последующим изучением продвижения и превращения вирусных частиц или их компонентов в клетках хозяина либо (если изучают синтез различных составных частиц вируса или клеточный метаболизм во время инфекционного процесса) радиоактивный изотоп добавляют к зараженной или подготовленной к заражению системе хозяина и делают соответствующие выводы на основании появления радиоактивности в определенных фракциях вируса или клетки.

И в том и в другом случае следует предварительно рассчитать необходимое количество меченого исходного продукта для оптимальной маркировки объекта наблюдения, соблюдая при этом два условия: предотвращение повреждающего действия излучения на биол. структуры и достижение оптимальных условий для подсчета радиоактивности.

Методы маркировки вируса.

Основное условие для успешной метки вируса - высокая концентрация радиоактивного изотопа. Наилучшим субстратом для этой цели является культура ткани; она позволяет применять большие дозы радиоактивности и, кроме того, меченый вирус, полученный в культуре ткани, содержит меньше посторонних примесей.

Методика получения меченого вируса состоит из нескольких этапов: 1) включение радиоактивных изотопов в структурные компоненты культивируемых клеток; 2) непосредственная метка вируса и 3) очистка вируса от радиоактивных примесей. Можно метить вирус, культивируя его в куриных эмбрионах, но уже в этом случае приходится считаться с влиянием больших доз изотопа на жизнеспособность эмбриона. Обычно на один эмбрион берут от 200 до 500 мккюри изотопа. Эту дозу радиоактивного соединения, разведенного в минимальном объеме инокуляционной среды, вводят одномоментно с вирусом или же сразу вслед за ним.

Еще сложнее метить вирус в организме животного. Принципиально и в таких условиях можно получить меченый вирус, однако существует правило, широко применяемое в ауторадиографии (см. т. 2): чем меньший объект необходимо пометить, тем большее количество изотопа следует ввести в организм. Причем дозировка изотопа увеличивается в значительно большей степени, чем уменьшается объект исследования. Обычно применяемые дозы 1-10 мккюри на 1 г веса могут вызвать лучевые повреждения; однако метка вируса в таких условиях низка, поэтому макроорганизм не является оптимальной средой для получения меченого вируса.

При изучении синтеза различных компонентов вируса или метаболизма инфицированных тканей для получения оптимальных условий счета импульсов достаточно вводить в среду дозы изотопа порядка 0,5-1-5 мккюри на 1 мл. Счетчик Гейгера - Мюллера не обеспечивает точного количественного определения импульсов от бета-излучателей с низкой энергией частиц (к излучателям этого типа относятся такие важные в биол. исследованиях изотопы, как тритий и отчасти С14 и S35). Для подсчета импульсов пользуются либо счетчиками 4П, либо жидкостными сцинтилляционными счетчиками, подсчитывая число импульсов каждого образца неоднократно по нескольку минут с обязательными статистической обработкой результатов и вычислением ошибки.

Метод ауторадиографии - другой способ обнаружения радиоактивных изотопов, нашедший широкое применение в вирусологии. Этот морфологический метод, основанный на потемнении фотографической эмульсии под действием излучения, позволяет точно локализовать вирус и их отдельные компоненты внутри клетки. Для ауторадиографии в качестве метки используются изотопы с малой энергией бета-частиц, образующие в эмульсии небольшие треки; лучше всего для этих целей подходит тритий. В зависимости от характера исследования в культуру ткани или организм вводят либо меченый вирус, либо любой содержащий радиоактивный изотоп-предшественник биосинтеза (тимидин-Н3 - при изучении ДНК, уридин-Н3- при изучении РНК, меченную по тритию аминокислоту - при изучении синтеза протеина). Расчет количества изотопа такой же, как было указано выше. После инкубации с изотопом и его отмывания готовят обычные гистологические препараты и фиксируют их. На них наносят тонкий слой ядерной эмульсии (типа Р, М или П), выдерживают в темноте для проявления зерен эмульсии под воздействием бета-частиц. Время экспозиции колеблется в зависимости от дозы и типа применяемого излучателя от нескольких недель до месяца. Препараты с проявленной эмульсией окрашивают одним из гистохимических методов.

При микроскопировании на фоне клеточных элементов видны проявленные темные зерна эмульсии, соответствующие локализации радиоактивного изотопа. Этот метод следует сочетать с количественной ауто-радиографией (подсчитывают суммарную площадь клетки и ее компонентов и число проявленных зерен над этими образованиями в определенном количестве клеток) или дополнять биохимическими исследованиями.

Применение изотопов в изучении физиологии вирусов.

Раскрытие механизма размножения вирусов и достигнутые в этой области успехи связаны в основном с изотопным методом, к-рый применяется для изучения адсорбции и проникновения вирусных частиц в восприимчивую клетку. Последний процесс требует для своего начала определенного подготовительного периода, вовремя к-рого достигаются критические концентрации составных частей, с одной стороны, и активация соответствующих ферментов, катализирующих синтез компонентов из них,- с другой. Изучение этих процессов тесно связано с проблемой "раннего" белка. Появление так наз. раннего белка связано в какой-то мере с образованием в инфицированной системе ферментов, синтезирующих вирусные нуклеиновые к-ты (тимидинкиназа, тимидилаткиназа, ДНК-полимераза и РНК-полимераза). Применение изотопной методики позволило изучить процессы, подготавливающие синтез специфических вирусных компонентов. При изучении синтеза отдельных компонентов вирусных частиц важно выяснить принципиальный вопрос, образуются ли они заново, используя компоненты среды, или путем утилизации клеточного материала. Эти вопросы также могут быть решены методом маркировки радиоактивными изотопами.

Изучение биосинтеза компонентов вируса проводится в двух направлениях. 1. Предварительно метят клеточный материал (Р32 метят нуклеиновые к-ты и фосфолипиды, мечеными аминокислотами - белок, специфическими предшественниками нуклеинового обмена - тимидином 2-С14 в уридином-2-С14 - ДНК или РНК). После тщательного отмывания от внедрившейся метки заражают культуру и определяют включение радиоактивности в нуклеиновые к-ты, протеин или фосфолипиды образовавшегося вируса. Таким путем выявляют степень утилизации клеточного материала в синтезе вирусных частиц. 2. При изменении постановки опыта и введении изотопа в немеченную культуру непосредственно перед заражением с последующим определением радиоактивноств в отдельных компонентах вируса можно определить, какой из них синтезируется заново. Степень включения изотопа в компоненты вирусной частицы находят методов хим. фракционирования вируса и подсчета активности в отдельных фракциях либо при помощи ауторадиографии. Последний метод имеет большое значение в изучении локализации и сроков начала синтеза вирусных нуклеиновых кислот.

Ауторадиографический метод определения синтеза вирусных нуклеиновый кислот и белка.

В различные сроки после инфицирования культуры ткани производят смену среды на содержащую специфический предшественник обмена, меченный тритием (тимидин Н3 - для ДНК-содержащих вирусов, уридин Н3 - для РНК-содержащих и Н3-лейцин или Н3-валин - для изучения белка) с удельной активностью изотопа 5-10 мккюри на 1 мл среды. После 30 мин. контакта с меткой культуру тщательно отмывают от невнедрившегося меченого предшественника и переводят в обычную среду. Препараты клеток неоднократно отмывают раствором Ханкса, фиксируют в смеси Карнуа и погружают в предварительно подогретую до 43° ядерную эмульсию, высушивают, экспонируют в течение 2 недель при 4°, проявляют. Все операции с эмульсией проводят в темноте. После окрашивания препарата определяют локализацию зерен и подсчитывают их количество. Одновременное применение метода флюоресцирующих антител позволяет определить в одних и тех же препаратах появление специфических вирусных нуклеиновых к-т и протеина.

Об изменениях обмена веществ в клетке под влиянием вирусной инфекции судят по включению меченого предшественника, специфичного для каждого вида обмена, в соответствующую фракцию конечного продукта, полученную биохимическим выделением. По методике эти опыты почти не отличаются от описанных выше методов определения синтеза вирусных частиц. При изучении метаболизма следует обязательно учитывать, какими путями может быть синтезирован конечный продукт и действительно ли меченый предшественник участвует в синтезе одного данного соединения. В противном случае требуется тщательный анализ с учетом всех побочных реакций, в к-рых может участвовать меченый предшественник.

О. Петерсон, О. Березина.

Влияние ионизирующей радиации на вирусные инфекции и противовирусный иммунитет.

Ионизирующая радиация в значительной степени влияет на механизмы естественной защиты организма, в т. ч. и противовирусной. Нарушение механизмов защиты организма, изменение клеточного метаболизма и многие другие стороны повреждающего действия ионизирующей радиации оказывают влияние на течение вирусных инфекций и формирование противовирусного иммунитета.

Все это особенно детально изучено на модели гриппа. Предварительное (до заражения) рентгеновское облучение сублетальными и летальными дозами рефрактерных к вирусу гриппа животных (белые крысы, морские свинки, кролики) повышает их чувствительность к вирусной инфекции и способствует развитию гриппозной пневмонии, нередко со смертельным исходом. У восприимчивых к вирусу гриппа белых мышей облучение с последующим заражением приводит к сокращению инкубационного периода, резкому отягощению инфекционного процесса и гибели животных (А. А.Смородинцев; В. Н. Сиверцева; О. П. Петерсон и И. А. Козлова).

Максимальное отягощение гриппозной инфекции и гибель животных наблюдаются при заражении их вирусом в ранние сроки (на 2-6-е сутки) после облучения сублетальными и летальными дозами. Резкое снижение резистентности организма именно в этом периоде обусловлено прежде всего снижением тканевой сопротивляемости; увеличение же проницаемости сосудов и тканей способствует более быстрому продвижению вируса гриппа к восприимчивым клеткам легочной ткани.

При заражении животных в более поздние сроки после облучения (на 21-30-е сутки) наблюдается меньшая чувствительность к вирусу гриппа. Это можно объяснить не только действием нек-рых компенсаторных защитных механизмов облученного организма, но также и тем, что в клетках легочной ткани, измененных под воздействием ионизирующей радиации, вирус гриппа не находит благоприятных условий для своего существования.

Восприимчивость облученных животных к нейровирусам.

Аммос (Н. L. Ammos) и др. наблюдали более выраженное течение полиомиелита у обезьян, облученных большими дозами по сравнению с контрольными животными. У облученных мышей уменьшалась резистентность к внутри-брюшинному и внутримозговому заражению вирусом полиомиелита. У кроликов при облучении понижалась естественная резистентность к вирусам вакцины [Клемменсон и Андерсен (J. Clemmenson, Е. Andersen)], у мышей - устойчивость к вирусу лимфоцитарного хориоменингита, острого рассеянного энцефаломиелита человека, вирус клещевого энцефалита, желтой лихорадки. Облучение неодинаково влияет на восприимчивость животных к разным вирусам, что зависит от патогенеза инфекции, продолжительности инкубационного периода и т. д.

В однотипных опытах на моделях различных вирусных заболеваний с коротким (3-5 дней) инкубационным периодом (грипп, энцефаломиокардит) показано, что у облученных животных отмечаются повышенная чувствительность к возбудителю, более тяжелое клиническое течение болезни, интенсивное размножение возбудителя в организме. Наиболее ярко это выражено при заражении животных через 48 часов после облучения, т. к. именно в этот срок происходит максимальное угнетение факторов естественной защиты, что обеспечивает более быстрый доступ вируса к клеткам чувствительных тканей. В эти сроки нарушается функция лимфоидных тканей, образующих антитела, а следовательно, и функция генеза антител.

В опытах на модели бешенства, относящегося к заболеваниям с продолжительным инкубационным периодом, наблюдаются иные закономерности. Вирус бешенства достигает чувствительных к нему клеток ц. н. с. спустя много дней после заражения (длительная инкубация), когда в нервных клетках нарушенные в результате облучения обменные процессы восстановлены; вследствие этого вирус уличного бешенства не находит благоприятных условий для существования.

Влияние облучения на образование противовирусных антител изучено гл. обр. на модели гриппозной инфекции. Показано значение последовательности введения антигена и облучения, доз облучения, кратности вакцинации. Наибольшее нарушение иммуногенеза наблюдается при облучении за 2 дня до иммунизации, что задерживает в последующем образование антител. Облучение, проведенное на высоте иммуногенеза (через 12-14 дней после окончания иммунизации), не влияет на образование антител. Угнетение антителообразования зависит от дозы облучения. Малые дозы (25-50 р) не влияют на титры антител; резкое снижение их наблюдается лишь при облучении в дозе 400 р.

При вакцинации облученных животных живым вирусом гриппа наблюдается большая их гибель по сравнению с контрольными, причем она зависит как от очередности облучения и введения вакцины, так и от дозы облучения.

Срок начала иммунизации облученных животных оказывает значительное влияние на формирование иммунитета.

Большая гибель наблюдается среди животных, к-рых иммунизируют сразу же после облучения. При иммунизации, начатой через 2 дня после облучения, не создается иммунитета к последующему заражению; индекс резистентности таких животных имеет отрицательное значение. Иммунизация, проведенная в этот срок, не повышает сниженной естественной резистентности облученных животных. Мыши, иммунизированные через 21 день после облучения, не отличаются по степени восприимчивости к вирусу от контрольной иммунной группы.

Т. о., облученных животных можно вакцинировать не ранее чем через 30 дней после облучения, т. е. в период восстановления после перенесенной лучевой болезни.

Влияние облучения на сформировавшийся иммунитет.

Облучение иммунизированных животных, проведенное через 12 и 21 день после вакцинации, резко снижает напряженность приобретенного иммунитета. Животные становятся восприимчивыми к вирусу, хотя такое облучение и не влияет на выработку антител. Это следует учитывать при вакцинации облученных животных (О. П. Петерсон, И. А. Козлова, А. А. Смородинцев).

Хроническое облучение и длительное облучение малыми дозами приводят к ослаблению естественного иммунитета. Ежедневное длительное рентгеновское облучение малыми дозами (9,5 р) снижает способность белых мышей вырабатывать противогриппозный иммунитет, что выражается в угнетении антителообразования и снижении резистентности к последующему заражению у облученных и иммунизированных животных. Эти нарушения наблюдаются после достижения суммарной дозы облучения (146,5 р). В отличие от однократного облучения, при длительном воздействии малых доз рентгеновых лучей полное угнетение процессов иммуногенеза не наблюдается даже при достижении суммарной дозы (700 р).

Т. о., нарушения противогриппозного иммунитета, вызванные длительным воздействием малых доз рентгеновых лучей, выражены слабее и менее стойки, чем при воздействии эквивалентных доз однократного общего облучения. После прекращения длительного облучения малыми дозами наступает быстрое восстановление нарушенной иммунобиологической реактивности, что свидетельствует о большой роли адаптационных и компенсаторных механизмов при хроническом облучении (О. Н. Березина, 1961).

О. Петерсон.

Реакция непрямой гемагглютинации при вирусных инфекциях.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА; син.: реакция пассивной гемагглютинации, реакция гемагглютинации сенсибилизированных эритроцитов) основана на адсорбции антигена поверхностью эритроцитов с последующей их агглютинацией специфической иммунной сывороткой. Механизм РНГА связывают также с изменением физ.-хим. свойств поверхности эритроцитов.

Бернет (F. М. Burnet) наблюдал агглютинацию нативных эритроцитов, обработанных вирусами болезни Ньюкасла и паротита; обработка эритроцитов вируса гриппа не сопровождалась агглютинацией. РНГА была воспроизведена с эритроцитами из крови цыплят, инфицированных вирусом болезни Ньюкасла [Эванс и Кернен (A. S. Evans, Е. S. Сuгnеn)], и получена при обработке нативных эритроцитов парагрнппознымп вирусами SV5, DA, SA [Айзексон (P. Isacson) и др.].

Перспективной для вирусологических исследований оказалась РНГА в модификации Бойдена (S. Boyden) с использованием танизированных эритроцитов, к-рые адсорбируют белковые антигены. РНГА, по Бойдену, разделяется на 2 фазы: 1) изменение свойств поверхности эритроцитов при адсорбции антигена; 2) адсорбция на сенсибилизированных эритроцитах антител с образованием конгломератов.

Положительная РНГА получена с аденовирусами, вирусом герпеса простого, клещевого энцефалита, бешенства, осповакцины, нек-рыми вирусами растений, вирусом куриной саркомы, возбудителями группы пситтакоза - лимфогранулемы - трахомы, микоплазмами. РНГА формалинизированных эритроцитов описана с вирусом полиомиелита и гепатита собак.

Специфическая РНГА с вирусом гриппа впервые получена отечественными исследователями, использовавшими методику Бойдена (А. С. Горбунова с сотр., Л.И. Соковых с сотр.). Сенсибилизирующий эритроциты антиген вируса гриппа - сенсибилпзин - не является вирусной частицей (вирионом) или гемагглютинином (V-антигеном). Этот особый вирусный антиген принадлежит к числу растворимых, но не идентичен комплементсвязывающему S-антигену.

Сенсибилизирующие антигены аденовирусов и возбудителя пситтакоза также являются растворимыми, в то время как сенсибилизирующая активность вируса герпеса простого, клещевого энцефалита, вируса растений связана с адсорбцией поверхностью эритроцитов целых вирусных частиц.

РНГА применяют в вирусологической практике для титрования антител при аденовирусной инфекции, в сыворотках вакцинированных против оспы, клещевого энцефалита, фиксированного вируса бешенства и др. Разные авторы готовят антиген для РНГА в соответствии с их представлением о его корпускулярной или растворимой природе. Чаще всего антигеном служит инфицированная вирусом аллантоисная жидкость куриных эмбрионов или вируссодержащая тканевая жидкость. Для определения антител к вирусу гриппа Р. И. Авроровой с сотр. предложен стойкий эритроцитарный диагностикум в виде формалинизированных эритроцитов лошади, обработанных танином и сенсибилизированных вируссодержащей аллантоисной жидкостью. РНГА строго специфична в отношении вируса гриппа А и Б.

Техника постановки РНГА разрабатывается для каждой вирусной инфекции особо. Процесс сенсибилизации определяется видом эритроцитов, концентрацией взвеси эритроцитов и сенсибилизирующего антигена, временем адсорбции, рН среды, температурой. Для сенсибилизации эритроцитов необходимо присутствие электролитов. Обработка эритроцитов танином вызывает спонтанную агглютинацию, для предотвращения к-рой используют стабилизатор (0,5- 1% раствор инактивированной кроличьей сыворотки). Разведения испытуемой сыворотки готовят на стабилизаторе.

Для вирусологических исследований РНГА применяется по прописям Ставицкого (А. B.Stavitsky) или Витебского (Е. Witebsky). Реакцию ставят на панелях или в пробирках. К серии разведений исследуемой сыворотки добавляют стандартную взвесь сенсибилизированных танизированных эритроцитов. Результаты учитывают по получении плотного осадка контрольных эритроцитов. Положительная РНГА-агглютинация эритроцитов, отрицательная РНГА-плотный осадок, как в контроле. РНГА является очень чувствительной серологической реакцией: в 100-1000 и более раз чувствительнее реакций торможения гемагглютинации, связывания комплемента и нейтрализации.

А. Горбунова.

Ионообменная хроматография как метод получения очищенных препаратов миксовирусов.

Освобождение вируса от присутствующих в среде балластных белков до недавнего времени проводилось преимущественно путем их адсорбции на эритроцитах различных лабораторных животных с последующими элюированием и дифференциальным центрифугированием.

Новым шагом в решении проблемы очистки и концентрирования вируса явилось использование синтетических ионообменников: ионообменных смол и ионообменников на целлюлозной основе. Ионообменные смолы не нашли широкого применения для очистки вируса из-за присущих им низкой адсорбционной емкости и гидрофобной матрицы, приводящей к инактивации вируса в процессе его очистки. Эти недостатки ионообменных смол были в основном преодолены после создания ионообменников, в основу к-рых положена целлюлоза, обладающая высокой адсорбционной емкостью по отношению к вирусу и гидрофильными свойствами. Синтетические ионообменники подразделяют на катиониты и аниониты и изготовляют на целлюлозе, используемой в виде порошковой либо волокнистой основы.

В практике работы с миксо- и парамиксовирусами используются анионные синтетические ионообменники, из которых наиболее часто употребляются аминоэтилцеллюлоза (АЭ), диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), триэтиламиноэтилцеллюлоза (ТЭАЭ) и др.

Целлюлозные ионообменники лучше адсорбируют вирусные белки в обессоленной среде. Понизить ионную силу вируссодержащего раствора особенно важно при работе с ионообменниками, изготовленными на основе порошковой целлюлозы. Снижение концентрации солей в этом случав обеспечивается при помощи диализа против воды либо фильтрованием такого раствора через гель сефадекса g-25. Готовый к работе синтетический ионообменник должен находиться в колонке в - ОН-форме и быть тщательно отмыт фосфатным буфером (рН = 7,2-7,3).

Целлюлозные ионообменники позволяют успешно вести хроматографические исследования различных гормонов, ферментов, антибиотиков, нуклеиновых к-т. С их помощью возможно отделение вирусного материала от невирусного, а также инфекционного вируса от неинфекционных вирусных антигенов и от свободных нуклеиновых к-т. При помощи колоночной хроматографии вируса гриппа А2 на АЭ-целлюлозе возможно получение препаративных количеств очищенного вируса. В результате одного хроматографического цикла достигается 5-10-кратное концентрирование вируса (по титру гемагглютининов); степень очистки по белку и нуклеиновой к-те колеблется между 94-99%.

Лучшие результаты дает очистка вируса гриппа на анионных ионообменниках типа ТЭАЭ-ДЭАЭ, изготовленных на основе волокнистой целлюлозы. Такие ионообменни ки обладают чрезвычайно высокой проходимостью матрицы. В этом случае вируссодержащая аллантоисная жидкость может быть подвергнута ионообменной хроматографии без предварительного понижения ее ионной силы. Такие целлюлозные ионообменники позволяют получать концентрированный вирус гриппа, характеризующийся очисткой по белку в среднем до 95%, по нуклеиновой к-те - до 99%.

Сочетание методов ионообменной хроматографии на ТЭАЭ-целлюлозе с методами адсорбции - элюирования вирусов с эритроцитов и последующего дифференциального центрифугирования позволяет повысить степень очистки вируса по белку и нуклеиновой к-те до 99,9%; степень концентрирования (по титру гемагглютинации) достигает при этом 400-500 раз при 50-55% выхода вирусов.

Наряду с очисткой и частичным концентрированием ряда миксо- и парамиксовирусов синтетические целлюлозные ионообменники позволяют также разделить вируссодержащую суспензию по меньшей мере ца два пика вирусной активности, различающиеся по биол. свойствам и характеризующиеся при одинаковой инфекционности различными титрами гемагглютинирующей активности. Т. о., метод ионообменной хроматографии позволяет выявить биол. неоднородность популяции вирусов.

При ионообменной хроматографии вируса болезни Ньюкасла на ДЭАЭ-целлюлозе наряду с достаточной очисткой вируса удается осуществить его фракционирование по гемолитической и гемагглютинирующей активности, а также установить наличие в популяции вируса неинфекционного гемагглютинирующего компонента.

Использование ТЭАЭ- и ДЭАЭ-целлюлозы для хроматографического фракционирования вируса Сендаи позволяет в значительной степени очистить вирус от примеси белков аллантоисной оболочки куриного Эмбриона, а также установить неоднородность частиц вируса в отношении их гемолитической активности: негемолитические гемагглютинирующие частицы, в отличие от основной массы вируса, обладающего гемолитическими свойствами, элюируют с обменника при более низкой ионной силе раствора соли.

Т. о., использование целлюлозных ионообменников для ионообменной хроматографии миксо- и парамиксовирусов позволяет накопить высокоочищенные и концентрированные вируссодержащие препараты и делает возможным хроматографическое фракционирование субъединиц вируса, получение вирусной РНК и их всестороннее изучение.

Я. Селиванов.