Тайны вирусов

...тысячи лет идет эта тихая невидимая война человека и вирусов...

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

ЛЕПТОСПИРОЗЫ (дополнение к ст. "Лептоспирозы", БМЭ, изд. II, т. 15).

Серологическая диагностика.

В соответствии с рекомендациями научной группы Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по лептоспирозам род Leptospira разделен на два вида: Leptospira biflexa, объединяющий сапрофитические, и Leptospira interrogans, объединяющий паразитические штаммы лептоспир.

Паразитические лептоспиры представлены 110 серологическими типами и подтипами, составляющими 14 серологических групп. В каждую группу включены типы и подтипы лептоспир, которые в перекрестной реакции агглютинации выявляют значительное антигенное родство.

В СССР известны возбудители лептоспироз десяти серологических групп: icterohaemorrhagiae, canicola, javanica, autumnalis, australis, grippotyphosa, pomona, hyos, s. tarassovi, hebdomadis и bataviae.

В сыворотках крови больных и реконвалесцентов присутствуют специфические антитела, соответствующие серотипу лептоспир-возбудителей, а также групповые и реже межгрупповые антитела. На обнаружении антител основана серологическая диагностика Д., в том числе один из основных ее методов - реакция агглютинации и лизиса (РАЛ) лептоспир сыворотками крови больных. Постановка РАЛ одновременно со всеми 110 серотипами и подтипами на практике неосуществима, a PAЛ с произвольно выбранными штаммами (например, только "местными" штаммами) не обеспечивает полного выявления больных. Отсюда вытекает необходимость унификации и стандартизации РАЛ.

Научная группа ВОЗ по лептоспирозам рекомендовала пользоваться для РАЛ набором штаммов - представителей всех серологических групп, которые обладают наиболее широким диапазоном внутригрупповых антигенных связей и могут обеспечить, следовательно, серогрупповой диагноз (табл.).

Набор, рекомендуемый для диагностики лептоспироз на территории СССР, включает диагностические штаммы, предложенные ВОЗ, а также штаммы отечественного происхождения, идентифицированные с международными эталонными культурами (в основном референс-лабораторией ВОЗ ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи). Для диагностики лептоспироз на территории Казахской ССР этот набор следует дополнять штаммами серотипов Kazachstanica I и II, описанных в этой республике как возбудители заболеваний людей и животных. Применение для всей страны единого диагностического набора позволяет не только обеспечить серогрупповой диагноз, но и получать сравнимые (стандартные) результаты по краевой этиологической структуре и по распространенности лептоспироз, относящихся к той или иной группе.

Для РАЛ пользуются 7-10-дневными живыми культурами, выращенными на одной из жидких питательных сред (культуры в полужидких средах для этой цели непригодны) и с достаточно пышным ростом, при наличии 50-100 лептоспир и более в поле зрения (объектив микроскопа Х40, окуляр Х10), без спонтанной агглютинации (клубочки, узелки из лептоспир) и посторонних примесей (осадок фосфатов и пр.). Кровь берут у больного или переболевшего из локтевой вены, пальца или мочки уха. Агглютинины и лизины в крови больных появляются на 7-8-й день болезни. В случае обнаружения антител в эти дни диагноз лептоспироза может быть окончательно установлен лишь при повторном исследовании сыворотки крови больного через 3-5 дней и в более отдаленные сроки и только при нарастании титров. Диагноз должен быть подкреплен клиническими наблюдениями и данными эпидемиологического анамнеза. Нужно иметь в виду, что у людей, леченных антибиотиками, процесс образования антител заторможен.

Диагностические штаммы лептоспир

Диагностические штаммы лептоспир

РАЛ ставится в пробирках или, что удобнее, на плексигласовых серологических пластинах с лунками посредством ряда последовательных разведений (схема). Круги изображают лунки (или пробирки). Два верхних ряда кругов (лунок) - рабочие разведения исследуемой сыворотки. Собственно PAЛ представлена, как и контроль культуры, в нижнем ряду; число таких, как этот, рядов должно соответствовать числу вводимых в РАЛ диагностических штаммов; с увеличением числа диагностических штаммов следует соответственно увеличить (при соблюдении указанных на схеме соотношений между сывороткой и физиологическим раствором) объем рабочих разведений сыворотки.

Схема приготовления разведений и постановка реакции агглютинации или агглютинации и лизиса в пластинах с лунками (цифры указывают количество капель, буквами обозначены лунки).

Схема приготовления разведений и постановка реакции агглютинации или агглютинации и лизиса в пластинах с лунками (цифры указывают количество капель, буквами обозначены лунки).

В лунки (пробирки) накапывают последовательно физиологический раствор, культуры лептоспир, сыворотку и ее разведения, причем используют одну и ту же пипетку (для обеспечения относительно равных объемов капель). После накапывания физиологического раствора и культур различных штаммов пипетку тщательно прогревают и высушивают на пламени горелки, а после закапывания сыворотки и каждого ее разведения многократно (не менее 3 раз) промывают физиологическим раствором. Пробирки (в штативах) встряхивают. Содержимое лунок на пластинах смешивают платиновой петлей (после каждого употребления петлю прокаливают). После выдерживания в термостате при t° 37° учитывают результаты РАЛ. С этой целью из каждой пробирки (лунки) берут пастеровской пипеткой по 1 капле, готовят на предметном стекле раздавленные капли и микроскопируют в темном поле. Для каждого ряда разведений, то есть для каждого штамма, пользуются отдельной пипеткой. Начинают приготовление препаратов с контролей и продолжают от наибольших разведений сыворотки к наименьшим.

Агглютинация проявляется в склеивании между собой большего или меньшего числа лептоспир, что выражается в образовании "пучков" и "кос", а также агглютинатов в виде больших шаров, покрывающих нередко по нескольку полей зрения. Лептоспиры при этом могут сохранять свою подвижность. Лизис проявляется сначала в образовании зернистости как у изолированных лептоспир, так и у лептоспир, подвергшихся агглютинации. Затем лептоспиры постепенно распадаются на фрагменты, теряя подвижность и превращаясь в скопление аморфных зернистых образований. Агглютинация и лизис протекают в первых разведениях сыворотки одновременно; однако чем выше разведение сыворотки, тем более преобладает агглютинация. В конечных разведениях лизис отсутствует.

Положительные результаты при учете РАЛ обычно обозначают крестами: большая часть лептоспир не повреждена, имеются отдельные клубочки агглютинированных лептоспир (+); от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы или лизированы (++); почти все лептоспиры агглютинированы или подверглись лизису (+++). Титр сыворотки определяется по наиболее высокому разведению сыворотки, где все еще наблюдается слабая (+) агглютинация лептоспир.

При необходимости исследования большого количества сывороток одновременно ставится ориентировочная РАЛ в разведениях 1:30, 1:100 и 1:300. При положительном результате реакция ставится затем в последующих разведениях до титра сыворотки. Антитела могут быть обнаружены не только в сыворотке крови больного, но и в моче, причем титр их в РАЛ значительно ниже, составляя не более 10% соответствующего титра сыворотки. За диагностический титр принимают положительную РАЛ в разведении 1:300 при условии нарастания титров в парных сыворотках. Как правило, титры сывороток больных на 15-30-й день от начала болезни достигают 1:10 000, 1:30 000 и выше. В дальнейшем они снижаются. В части случаев антитела в крови переболевших обнаруживаются при помощи РАЛ в течение многих месяцев и даже лет, что делает возможным ретроспективный диагноз.

Определение серологического типа возбудителя болезни возможно лишь после выделения штамма лептоспир (из крови, мочи и пр.) больного и его идентификации путем перекрестной агглютинации с иммунными сыворотками против этого штамма и музейных (эталонных) штаммов с применением метода абсорбции антител. Два штамма считаются принадлежащими к различным серотипам, если после перекрестной абсорбции адекватным количеством гетерологичного антигена 10% или более гомологичного титра сохраняется регулярно при повторных исследованиях в каждой из исследуемых сывороток [Вольфф, Брум (J. Wolff, J. Broom), 1954]. При сохранении менее 10% гомологичного титра оба штамма считаются принадлежащими к одному и тому же серологическому типу.

В. Ананьин, Ю. Чернуха.