Тайны вирусов

...тысячи лет идет эта тихая невидимая война человека и вирусов...

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

БАКТЕРИИ (дополнение к ст. "Бактерии", БМЭ, изд. II, тт. 3 и 36).

Структура и функции бактерий.

Многочисленные исследования тонкой структуры бактерий показали, что бактериальная клетка представляет собой сложную биологическую систему, в составе которой имеются все механизмы, необходимые для осуществления различных функций, присущих живому организму.

Все бактерии делятся на две группы: грамположительные и грамотрицательные. Бактерии обладают рядом морфологических и физиологических различий, основные из которых: строение клеточной стенки, способ деления, развитие и строение мембранных структур, чувствительность к антибиотикам и т. п.

Установлены следующие структурные компоненты бактериальной клетки: поверхностные структуры (жгутики, капсулы, клеточная стенка), цитоплазматическая мембрана и мембранные структуры, цитоплазма (рибосомы, включения, вакуоли), нуклеоид.

Жгутики являются органоидом движения со строго упорядоченной молекулярной структурой. Они состоят из гексагонально расположенных субъединиц диам. 45- 50 А, уложенных в спираль (с шагом спирали 200-250 А). Толщина жгутиков колеблется в пределах 100-200 А. Жгутики начинаются от базальных гранул, располагающихся в цитоплазме, и выходят наружу через клеточную стенку. Базальные гранулы локализуются вблизи цитоплазматической мембраны и представляют собой нежные мембранные образования в виде колец [Ван-Итерсон (W. Van Iterson) с сотр., 1966). Жгутики состоят в основном из протеинов, относящихся к группе кератин-миозин-эпидермин-фибриноген. Некоторые авторы считают жгутики сократительной системой, аналогичной мышечному волокну. У отдельных штаммов бактерий Е. coli на поверхности клеточной стенки при помощи электронного микроскопа обнаружены нитевидные отростки, так наз. пили, диам. 30-80 А и длиной 0,2-20 мк. Они имеют спиралевидную структуру с шагом спирали 24 А. Предполагают, что эти отростки полые и что при конъюгации бактерий с их помощью осуществляется передача генетической информации (ДНК).

Рис. 1. Corynebacterium diphtheriae. Микрокапсула и мембранные структуры (Х80 000).

Рис. 1. Corynebacterium diphtheriae. Микрокапсула и мембранные структуры (Х80 000).

Ряд бактерий, как патогенных, так и непатогенных, характеризуется способностью образовывать снаружи клеточной стенки капсулу, обладающую определенной структурой и этим отличающуюся от других слоев. Изучение целых неокрашенных клеток в электронном микроскопе показало, что капсулы имеют вид равномерного гомогенного слоя низкой электронно-оптической плотности и лишь в редких случаях выявляется их поперечная исчерченность. Цитохимическими методами исследования установлены многослойное строение бактериальных капсул и природа отдельных слоев (В. anthracis; А. А. Авакян с сотр., 1965). Методы световой иммунохимии и цитохимии позволили установить топографию капсульных антигенов и дифференцировать их от антигенов клеточной стенки (В. anthracis). У некоторых бактерий, которые считались некапсульными, при помощи ультратонких срезов были выявлены микрокапсулы. Размеры их лежат за пределами разрешающей способности обычного светового микроскопа. Микрокапсулы были обнаружены у Mycobacterium, С. diphtheriae и некоторых других бактерий (рис. 1). Капсулы бактерий полифункциональны, являясь у одних бактерий носителем антигенов, у других - защитным покровом клетки, у третьих - источником запасных питательных веществ. Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов целых бактерий и изолированных клеточных стенок, а также методы химического фракционирования позволили рассматривать клеточную стенку как сложное структурное образование неодинакового строения и химического состава у грамположительных и грамотрицательных бактерий. На ультратонких срезах клеточная стенка большинства грамотрицательных бактерий представлена извилистой трехслойной липопротеидной мембраной толщиной 75-90 А и внутренним мукопептидным слоем непостоянной толщины и электронно-оптической плотности (рис.2), ответственным за сохранение формы клетки. Клеточная стенка грамположительных бактерий не имеет наружной липопротеидной мембраны и обычно лишена закономерной слоистости, толщина ее колеблется от 100 до 800 А. Получены интересные данные о том, что некоторые патогенные анаэробы (Cl. tetani, Cl. botulinum А и В) имеют слоистую клеточную стенку и наружную мембрану (рис. 3). Ригидный каркас клеточной стенки грамположительных бактерий также составляют мукопептиды, по своей природе сходные с мукопептидами грамотрицательных бактерий. Однако клеточная стенка грамотрицательных бактерий имеет более сложный химический состав и содержит 20% липидов, большой процент белков, включая ароматические и серусодержащие аминокислоты, а также аргинин, гистидин, пролин, моно-и полисахаридные комплексы. С помощью негативного контрастирования и цитохимических методов выявлено строго упорядоченное молекулярное строение поверхности клеточной стенки, состоящей из субъединиц в виде шестигранников размером 70-100 А (рис. 4). Различия, существующие в строении клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий, находят свое отражение в способе их деления. Так, большинство грамотрицательных бактерий делится путем простой перетяжки (рис. 2). У грамположительных бактерий этот процесс намного сложнее. Материал клеточной стенки грамположительных бактерий синтезируется постепенно, в результате чего формируются поперечные перегородки. Помимо участия клеточной стенки в процессе деления и в обеспечении сохранения формы клетки, имеются данные, свидетельствующие об участии стенки в процессе поступления и выделения различных веществ, о ее роли в формировании антигенных комплексов, обусловливающих антигенную специфичность различных видов бактерий.

Рис. 2. Brucella melitensis. Видна наружная мембрана клеточной стенки, цитоплазматическая мембрана. Деление перетяжкой (Х50 000).

Рис. 2. Brucella melitensis. Видна наружная мембрана клеточной стенки, цитоплазматическая мембрана. Деление перетяжкой (Х50 000).

Рис. 3. Clostridium tetani. Слоистая клеточная стенка и субъединицы на ее поверхности (Х150 000).

Рис. 3. Clostridium tetani. Слоистая клеточная стенка и субъединицы на ее поверхности (Х150 000).

Рис. 4. Фрагмент клеточной стенки Salmonella typhimurium. Видны субъединицы (х200 ООО).

Рис. 4. Фрагмент клеточной стенки Salmonella typhimurium. Видны субъединицы (х200 ООО).

За клеточной стенкой располагается один из жизненно важных органоидов бактериальной клетки - цитоплазматическая мембрана. Она легко выявляется у грамотрицательных бактерий в виде трехслойной мембраны в 75-80 А, построенной по типу мембраны Робертсона (рис. 2). У грамположительных бактерий часто наблюдается более плотное примыкание цитоплазматической мембраны к клеточной стенке. При этом цитоплазматическая мембрана имеет такое же строение, как и у грамотрицательных бактерий (рис. 3). Цитоплазматическая мембрана выполняет роль осмотического барьера. Предполагают, что она активно участвует в синтезе клеточной стенки делящейся бактерии и является средоточием ферментов, в частности ферментов переноса электронов (Н. С. Гельман с соавт., 1966) и окислительных ферментов. Цитоплазматическая мембрана, вдаваясь внутрь цитоплазмы бактерии, образует мембранные структуры (мезосомы). Сложные мембранные структуры были описаны у ряда грамположительных бактерий (рис. 1). У большинства грамотрицательных бактерий мембранные структуры не отличаются сложностью строения. Мембранные структуры как аэробных, так и анаэробных бактерий принимают участие в делении клетки, спорообразовании, возможно осуществляют выделительную функцию; имеются данные об участии их в синтезе белка. Установлено, что в мембранных структурах бактерий локализуются окислительные ферменты (И. X. Торджян и Л. Н. Кац, 1968).

В 1968 г. получены биохимические и морфологические доказательства связи ДНК с мембранными структурами (A. Ryter). Таким образом, мембранные структуры бактериальной клетки являются полифункциональными. Электронно-микроскопическое изучение изолированных фракций мембранных структур методом негативного контрастирования выявило в них новые детали строения. На поверхности мембран располагаются грибовидные субъединицы в 80 А, причем, в отличие от митохондрий, эти субъединицы обнаружены только на одной стороне мембраны (Бирюзова с соавт., 1964). В бактериальной клетке типичных митохондрий не обнаружено.

Цитоплазма бактерий состоит из отдельных гранул-рибосом или их скоплений - полирибосом. Рибосомы бактериальной клетки по своим размерам (150-200 А) и строению сходны с рибосомами животной клетки. Полирибосомы нередко обнаруживают связь с цитоплазматической мембраной и мембранными структурами бактерий. Синтез белка бактериальной клетки осуществляется полирибосомами. Структурная организация рибонуклеопротеина детально изучена у Е. coli (Е. В. Kingsbury, Н. Voelz, 1968).

В цитоплазме бактерий содержатся различные включения: например, включения волютина обнаруживаются часто у коринебактерий и микобактерий. На ультратонких срезах волютин имеет вид осмиофильных гранул, окруженных сетчатым материалом. Цитохимические исследования показали, что наружный слой имеет рибонуклеопротеидную природу, внутренний - преимущественно полифосфатную.

Поскольку процесс выработки волютина полностью еще не изучен, его функциональная роль в жизни бактериальной клетки также не установлена. Исследования последних лет позволяют думать, что волютин является поставщиком макроэргических фосфатных соединении, энергия которых расходуется на синтез белков, нуклеиновых кислот и липидов. Существует и другая точка зрения о том, что волютин является промежуточным метаболитом. В цитоплазме бактерий обнаружены также включения гликогена и жира. У бактерий не обнаружено ни аппарата Гольджи, ни типичного эндоплазматического ретикулума, присущих животной и растительной клеткам.

Нуклеоид бактерий представляет морфологическую структуру, которая отличается от ядер растительной и животной клетки отсутствием оболочки, ядрышка, а также митотического аппарата. Нуклеоид бактерий представлен "ядерной вакуолью", заполненной фибриллами толщиной 25-40 А. Предполагают, что нуклеоид бактерий содержит все основные компоненты, свойственные ядрам клеток высших организмов (ДНК, РНК и белки). Соотношение ДНК, РНК и белка в нуклеоиде составляет 1:1:3. Бактериальный нуклеоид является сложной морфологической структурой, одной из основных функций которой является передача наследственных признаков.

За последние годы благодаря комплексным методам исследования в изучении структуры бактерий сделаны большие успехи. Однако функциональные особенности отдельных структур бактериальной клетки изучены еще недостаточно. А. Авакян, и. Павлова.

Рост и репродукция бактерий.

Проблема роста и репродукции клеток является одной из важнейших в современной биологии. Внимание исследователей сосредоточено на изучении механизмов, регулирующих процессы роста и деления клетки. Значительный прогресс в раскрытии некоторых механизмов этих явлений был достигнут в результате исследования микробных систем и, в частности, бактерий.

Прежде всего необходимо было установить механизмы, обеспечивающие копирование генетического материала в бактериях. Генетический материал бактерий представлен нуклеоидами, являющимися эквивалентом ядра клеток высших организмов. С молекулярной точки зрения нуклеоид представляет собой гигантскую молекулу ДНК. Первое удовлетворительное изображение бактериальной ДНК было получено в 1961 г. Клайншмидтом, Лангом и Цаном (A. Kleinschmidt, D. Lang, R. К. Zahn), которые выделили ДНК из протопластов Micrococcus lysodeicticus. По данным электронной микроскопии, нативная ДНК этого микроба представлена замкнутой структурой.

Существование в бактерии одной молекулы ДНК и ее циркулярной структуры было показано в радиографических опытах Кейрнса (J. Cairns, 1962), который продемонстрировал кольцевую структуру ДНК Е. coli, имевшей размер от 1000 до 1400 мк. Циркулярная структура хромосомы Е. coli доказана чисто генетическими данными, полученными при определении частоты переноса отдельных генов при конъюгации. Из этих опытов также следует, что для хромосомы Е. coli характерно наличие кольцевых перестановок по ее генетической карте. Однако не исключено, что молекулярная организация хромосомы других бактерий отличается от описанной у Е. coli. Так, пока не удалось радиоаутографически показать циркулярность хромосомы В. subtilis. Скорость репликации хромосомы бактерий зависит от характера среды культивирования. По подсчетам Болдвина (R. Baldwin, 1967), скорость репликации хромосомы Е. coli в упомянутых опытах составила 20-30 мк в 1 мин., что соответствует полимеризации 3000 нуклеотидов в 1 сек. Близкие величины скорости репликации хромосомы установлены для В. subtilis; в случае культивирования в обогащенной среде скорость равнялась 40 мк в 1 мин., а в ацетатной среде или в среде, содержащей сукцинат, - 6 мк [Эберле, Ларк (Н. Eberle, К. G. Lark), 1967].

Сопоставление скорости деления бактерий с интенсивностью синтеза ДНК, проведенное на S. typhimurium [Шехтер (М. М. Schaechter), Бенсон (М. Benzon), Моле (О. Maalej, 1959; Шехтер, Моле, Кьельдгард (N. Kyeldgaard), 1958] и Е. coli [Ларк (С. Lark), 1966], указывает на существование тесной взаимосвязи между скоростью деления клетки и содержанием в ней ДНК. В случае Е. coli в среде, содержащей глюкозу, время, необходимое для деления клетки, равнялось 40 мин. и соответственно содержание ДНК в микроорганизмах на 107 бактерий равнялось 0,138 мкг. Если в качестве источника энергии вместо глюкозы использовался пролин, то время генерации бактерий возрастало до 180 мин., а содержание ДНК в ней на 107 клеток равнялось 0,05 мкг.

Опыты Мезельсона и Сталя (М. Meselson, F. Stahl), проведенные в 1958 г., совершенно четко подтвердили предсказания Уотсона и Крика (J. D. Watson, F. Н. Crick) о полуконсервативном механизме репликации ДНК in vivo. Однако в течение ряда лет оставалось непонятным, с какого участка начинает копироваться бактериальная хромосома, в каком направлении осуществляется репликация, каковы механизмы, регулирующие этот процесс, и каково взаимоотношение между репликацией бактериальной хромосомы и процессом деления клетки.

Вскоре были получены данные, указывающие, что, в отличие от бесклеточных систем, копирование ДНК в интактной бактерии начинается с определенной точки (репликативная точка) и совершается лишь в одном направлении. Радиоаутографические доказательства этого были предложены Кейрнсом (1962, 1963), который представил радиоаутограммы хромосомы Е. coli К-12 Hfr на разных этапах ее удвоения. Другое доказательство полярности удвоения бактериальной хромосомы было получено в опытах трансформации в системе В. subtilis [Суэока, Иосикава (N. Sueoka, Н. Yoshikawa), 1963]. В этих экспериментах подвергалась сравнению трансформирующая активность препаратов ДНК, выделенных из стационарных и экспоненциальных культур В. subtilis. Теоретическая предпосылка, положенная в основу этих опытов, заключается в следующем. Если репликация хромосомы полярна, то в культуре, находящейся в экспоненциальной фазе роста, количество генов, расположенных ближе к исходной точке репликации, будет приблизительно в 2 раза больше, чем генов, локализованных на терминальном конце хромосомы. Действительно, опыт показал, что частота трансформации В. subtilis по 11 генетическим признакам хорошо согласуется с идеей полярности репликации хромосомы. Впоследствии этот механизм репликации хромосомы у В. subtilis был показан в опытах с изотопами. Клетки В. subtilis выращивались в среде с тяжелыми изотопами водорода, затем их переносили в "легкую" среду (Н20-N14), после чего в различные моменты от времени переноса из порций клеток извлекали ДНК и измеряли скорость формирования гибридных (тяжелая - легкая) молекул ДНК, которую сопоставляли с ее трансформирующей активностью. Результаты этих опытов продемонстрировали соответствие интенсивности появления гибридных молекул ДНК удвоению генетических маркеров. Так же как и в предыдущих опытах, первым в хромосоме В. subtilis реплицирован маркер ade, а последними met и ileu (Суэока, Йосикава, 1963).

Реальность предшествования начальной точки репликации бактериальной хромосомы показана в опытах Нагаты (Т. Nagata, 1963), который изучал взаимоотношение между синтезом бактериальной ДНК и увеличением числа профагов в лизогенных штаммах Hfr Е. coli, К-12. Им были использованы два Hfr-штамма, каждый из которых был лнзогенен по двум фагам: λ и 424. В штамме HfrH расстояние от места локализации этих фагов в хромосоме до F-фактора, выраженное в процентах общей длины хромосомы, равнялось соответственно 83 и 52,8, а в штамме HfrCs101-5,5 и 38. Сравнение интенсивности синтеза ДНК в синхронированных культурах этих штаммов с количеством индуцированных УФ фагов λ и 424 показало, что в штамме HfrH удвоение числа фага λ соответствует приросту ДНК на 80%, а удвоение титра фага 424 совпадает с моментом прироста ДНК, равным 48,3%. Аналогичное совпадение этих двух величин было установлено и в штамме HfrCs101. Нагата пришел к заключению, что репликация хромосомы в Hfr клетках Е. coli осуществляется полярно, начиная от точки F. Опыты Нагаты принципиально соответствуют данным, касающимся механизма репликации хромосомы донорного штамма Hfr в процессе конъюгации, которые также указывают на полярность репликации хромосомы бактерий.

Однако этим данным противоречили результаты, полученные самим Нагатой при изучении репликации хромосомы в F--штаммах, и аналогичные данные, полученные при изучении этого же процесса у В. subtilis W168 (Суэока, Йосикава, 1963). Результаты этих исследований как будто бы указывали на существование неполярного механизма репликации хромосомы. Последующие опыты, проведенные на названных В., отвергли высказанные сомнения и подтвердили полярность репликации хромосомы бактерий.

Все эти факты, однако, сами по себе не объясняли, каким образом в бактериях осуществляется регуляция репликации хромосомы и каковы механизмы, координирующие процесс ее деления с делением самой клетки. Современные представления о регуляции репликации хромосомы базируются на концепции Жакоба, Бреннера, Кюзена (F. Jakob, S. Brenner, F. Cuzin, 1963) о существовании в бактериальной клетке специализированной регулирующей системы, так наз. репликона. Под репликоном понимают организованную генетическую структуру, способную к самостоятельной репликации, координированной с ростом бактериальной клетки. Исходя из этого определения, к репликонам следует отнести хромосомы бактерий, F-фактор и др. Главное свойство репликона - его способность реплицироваться как единое целое. Если в клетке существуют одновременно два репликона, например хромосома и автономный F-фактор, то они реплицируются независимо друг от друга, то есть в каждом из них существуют детерминанты, регулирующие их репликацию. Функционирование организованной генетической структуры как репликона зависит от наличия в нем и особых структур, активно регулирующих репликацию. Одна из них, вероятно, относится к категории структурных генов, которая контролирует синтез белка, активирующего начало репликации хромосомы. Это вещество названо инициатором. Структурный ген, определяющий синтез инициатора, функционирует в бактериях непостоянно: он способен воспринимать сигналы из протоплазмы клетки, то есть активироваться в определенный период роста бактерий. В связи с тем, что функция инициатора сводится к активированию процесса репликации, систему регулирования такого типа называют позитивной, в отличие от негативной, при которой цитоплазматический репрессор, действуя через ген-оператор, угнетает функционирование соответствующих структурных генов.

Второй структурой репликона является так наз. репликатор, то есть тот специфический участок хромосомы, откуда и начинается ее репликация. Допустив, что инициаторы, продуцированные генами разных репликонов (хромосома В., F-фактор), специфичны, то есть действуют на репликатор только своего репликона, Жакоб и соавт. этим объясняют причину независимости репликации F-фактора от репликации хромосомы клетки. Концепция Жакоба и соавт. получила подтверждение прежде всего в экспериментах, которые завершились выделением бактериальных термочувствительных мутантов (Жакоб, Бреннер, Кюзен, 1963), в которых была нарушена система репликации F-фактора без нарушения хромосомных генов. Биохимические доказательства реальности модели репликона были получены в серии работ, выполненных Притчардом и супругами Ларк (R. H. Pritchard, К. G. Lark, С. Lark, 1964), в которых изучена репликация бактериальной хромосомы в бактериальных мутантах, не синтезирующих тимин и подвергнутых тиминовому и аминокислотному голоданию. Если тиминозависимые клетки, подвергнутые голоданию, перенести в среду, содержащую тимин, то ход репликации хромосомы искажается. В таких клетках индуцируется подавленный синтез ДНК и репликация хромосомы продолжается от двух точек: от точки, до которой прошла репликация, начатая до тиминового голодания, и вновь от исходного участка, с которого в норме реплицируется хромосома. В дальнейшем было показано, что эффект, наблюдаемый при переносе бактерий, подвергнутых тиминовому голоданию, в среду с тимином, угнетается хлорамфениколом и 5-фторурацилом. Наряду с этим известно, что аминокислотное голодание бактерий также влияет на репликацию хромосомы, а именно: при дефиците аминокислот репликация хромосомы не начинается, но если она началась до голодания, она продолжается до конца, хотя синтез ДНК осуществляется с меньшей скоростью (супруги Ларк, 1966). В отличие от случая, описанного при тиминовом голодании, репликация хромосомы после аминокислотного голодания начинается от исходной точки и только после завершения первого цикла репликации. Репликация хромосомы, восстанавливающаяся после аминокислотного голодания, резистентна к хлорамфениколу и 5-фторурацилу. На основе этих данных предполагается, что регуляция репликации бактериальной хромосомы связана с наличием в клетке двух белков, один из которых выявляется после тиминового голодания и синтезируется с участием РНК, а второй, необходимый для запуска репликации, относится к классу полинуклеотидов, синтез которых резистентен к хлорамфениколу. Притчард и К. Ларк (1964) допускают, что белок второго типа включен в структуру хромосомы и что он объединяет точку начала репликации с концом хромосомы. Возможно, что белок второго типа представляет собой компонент клеточной стенки в участке прикрепления к ней хромосомы. Реальность существования связи между хромосомой бактерии и белком поверхностных структур была показана в исследовании Жакоба и др. (1966). Этот результат нашел также подтверждение в комбинированных опытах с флюоресцирующими антителами и радиоаутограммами, в которых была показана физическая связь между бактериальной ДНК и структурами поверхности клетки [Чей, Ларк (N.-C. Chai, К. G. Lark), 1967].

На основе всех этих данных К. Ларк (1966) предложил новую модель удвоения бактериальной хромосомы, в которую внесены существенные дополнения к системе, предложенной Жакобом и соавт.

Согласно модели Ларка, хромосома бактерии прикрепляется к внутренней стороне клеточной мембраны только одной нитью молекулы ДНК. Таким образом, одна из нитей кольцевой хромосомы бактерии разорвана, а вторая в замкнутом состоянии фиксирована на специализированном участке клеточной мембраны, который и представляет собой репликатор. Второе однонитчатое кольцо разрывается, и к одному из его концов прикрепляется белок-инициатор. Эта нить также фиксируется на внутренней стороне мембраны в участке, соседнем упомянутому выше репликатору. Копирование хромосомной ДНК осуществляется вдоль нити, на которой фиксирован инициатор, прикрепленный к новому участку бактериальной мембраны, и одновременно вдоль второй кольцевой нити, фиксированной на старом участке мембраны. Таким образом, по окончании цикла репликации в клетке оказываются две полноценные хромосомы бактерии, каждая из которых прикреплена к своему репликатору. Из этой модели видно, что нити, прикрепленные к мембране, осуществляют функцию шаблона, на котором синтезируются копии. В промежутке мембраны между двумя репликаторами формируется перемычка между дочерними клетками. Сигналом для начала последнего процесса является завершение синтеза копируемых нитей ДНК. Модель Л арка объясняет, каким образом в каждой дочерней клетке оказывается одна нить - шаблон родительской хромосомы. В этой модели объясняется также взаимоотношение между временем генерации клетки и условиями ее существования. Неполноценность пита-тельной среды уменьшает скорость роста бактерии и соответственно скорость формирования в ней репликаторных и инициаторных белков, следствием чего оказывается торможение различных этапов удвоения хромосомы бактерии, а это в свою очередь влечет за собой торможение деления клетки. В системе Ларка предусмотрен и возможен механизм, обеспечивающий развинчивание двунитчатой хромосомы бактерии в процессе ее репликации. Им может быть разрыв копируемой нити и прикрепление ее к новому участку мембраны, что обеспечивает ее последующее отделение от комплементарной нити.

В процессе расщепления нитей, вероятно, принимают участие специальные ферменты.

Из сказанного следует, что рост и деление клетки - процессы взаимосвязанные. Однако их можно дифференцировать, нарушив координацию между ними. Этого удается достичь, блокировав деление и сохранив при этом способность к росту. Явление такого рода называют несбалансированным ростом. Несбалансированный рост бактерии наблюдают в условиях нарушения синтеза ДНК, которое может быть вызвано тиминовым голоданием или же формированием в молекуле ДНК поперечных скрепок в результате обработки бактерии такими агентами, как митомицин С, азотистый аналог иприта и пр.

В этих случаях наблюдается формирование нитевидных особей при сохранении способности клетки синтезировать белки, РНК и ДНК (Д. М. Гольдфарб, Ю. К. Фомичев, Н. Б. Борисова, 1963). В нитевидных клетках при накапливании ДНК нарушен процесс нормального формирования ядра, что было показано Фомичевым цитоморфологически (Ю. К. Фомичев, 1963).

Наряду с этим в таких клетках не формируется клеточная перегородка.

Механизм этого явления можно объяснить, исходя из того, что такое соединение, как азотистый иприт, формирует поперечные связи в молекуле ДНК и тем самым нарушает либо расхождение реплицированных хромосом, либо сам процесс репликации.

Исходя из моделей Жакоба и Ларка, при этом может быть нарушен стимул, приводящий к образованию клеточных перегородок, что и вызывает появление нитевидных форм. Повреждения функции деления клеток, вызываемые азотистым ипритом, репарируются клеткой за счет ферментативных репарирующих систем, в частности ферментным комплексом, связанным с рекомбинацией (рекомбиназы). Было показано, что количество делящихся особей после действия азотистого иприта сначала уменьшается (эффект последействия), а потом начинает возрастать при инкубации таких клеток в течение определенного периода в нормальной среде. Наибольшей чувствительностью к действию азотистого иприта как блокатору деления обладают rec- клетки, лишенные комплекса рекомбиназ.

Функцию деления клетки, угнетенную азотистым ипритом, можно восстановить, если ввести путем конъюгации в обработанные ипритом бактерии интактную ДНК.

Это было показано в опытах, в которых обработанный азотистым ипритом реципиент скрещивали с нормальным Hfr или F-донором.

Восстановление функции деления при этом наблюдалось в том случае, когда поврежденным реципиентом был F- rec+ штамм (Д. М. Гольдфарб, Ю. К. Фомичев, Е. В. Лобанок, 1967). Все это указывает на тесную связь между процессами регуляции деления с рекомбиназными ферментами клетки. См. также Генетика микроорганизмов (Ежегодник I).

Д. Гольдфарб.

Мутагенез у бактерий.

Бактериальный мутагенез - сумма процессов, осуществление которых приводит к формированию мутантов, то есть бактерий, обладающих наследственно закрепленными измененными свойствами. К мутациям принято относить только те изменения генотипа бактерий, которые не связаны с интеграцией чужеродного генетического материала (то есть с генетическими рекомбинациями, возникающими при конъюгации, трансформации или трансдукции).

По своему конечному эффекту рекомбинационные изменения могут быть идентичны мутациям, однако при изменениях этого рода в бактериальную клетку привносится уже готовая генетическая информация. Мутации же являются следствием перестройки собственного генома бактериальной клетки. В молекулярном выражении мутации следует рассматривать как изменение последовательности нуклеотидов. По характеру перестроек молекул ДНК мутации подразделяют на генные и хромосомные. Генные мутации - это изменения в пределах одного гена. Они могут заключаться в заменах отдельных пар оснований ДНК. Замены могут быть простыми и сложными или перекрестными. Первые заключаются в обмене пуринов (А↔Г) или пиримидинов (Т↔Ц) и приводят к заменам АТ↔ГЦ (А - аденин, Г - гуанин, Т - тимин, Ц - цитозин). Этого рода замены часто именуют транзициями. Перекрестные замены (трансверсии) заключаются во взаимном обмене пуринов и пиримидинов. При этом возникают следующие замены:

Внутригенные мутации могут представлять собой вставки либо выпадения (делеции) отдельных пар оснований. Делеции могут быть различной протяженности: выпадению могут подвергаться от одной пары до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Они могут распространяться за пределы гена и в этом случае расцениваются как хромосомные мутации. К хромосомным мутациям, помимо наиболее часто образующихся делеций, относятся дупликации (удвоение отдельных участков хромосомы), а также инверсии (повороты участков хромосом на 180°).

Относительно изменения фенотипа мутации подразделяются на прямые и обратные. Прямая мутация приводит к изменению дикого, то есть обычно встречающегося фенотипа в мутантный. Так, дикие типы прототрофных бактерий кишечной палочки размножаются в глюкозо-солевой среде, лишенной каких-либо источников органического питания. Ауксотрофы этих бактерий, зависимые от тех или иных веществ, возникают в результате прямых мутаций.

Истинные обратные мутации заключаются в восстановлении исходного (дикого) состояния гена. Восстановление дикого фенотипа при истинной обратной мутации происходит благодаря полному восстановлению генотипа. Истинные обратные мутации могут быть получены в том случае, если прямая мутация была вызвана простой заменой пары оснований. Обратная замена при этом восстанавливает исходное состояние гена (АТ→ГЦ - прямая мутация; ГЦ→AT - истинная обратная мутация).

Полное или частичное восстановление дикого фенотипа может происходить при сохранении прямого мутационного изменения в геноме бактериальной клетки. В этом случае восстановление фенотипа происходит в результате вторичной мутации, супрессирующей (подавляющей) выражение первичного прямого мутационного изменения. Супрессорные мутации могут локализоваться в том же гене, что и прямая мутация. Такая ситуация эффективна в том случае, если прямая мутация связана со вставкой либо с выпадением пары оснований ДНК. В результате изменения такого рода происходит сдвиг в считывании генетической информации, что приводит к ее искажению. Изменение противоположного типа (выпадение или вставка соответственно) восстанавливает правильное считывание на участке гена, следующем за вторичной (супрессорной) мутацией. Чем ближе супрессорная мутация примыкает к первичному мутационному изменению, тем короче участок гена, с которого считывается искаженная информация, и тем, следовательно, полнее восстановление дикого фенотипа. Эта закономерность может быть продемонстрирована схемой, изображенной на рис. 5.

Анализ подобных прямых и супрессорных мутаций позволил установить ряд закономерностей процесса транскрипции, то есть считывания информации с ДНК в процессе построения молекулы РНК. Эти же мутации оказались весьма совершенной моделью для определения кодонов, соответствующих отдельным аминокислотам.

Из сказанного выше следует, что восстановление фенотипа при внутригенных супрессорных мутациях происходит на уровне процесса транскрипции (считывания).

Действие внегенных супрессорных мутаций обусловлено другими механизмами. В данном случае супрессорные мутации локализуются за пределами генов, несущих прямые супрессибельные изменения. Механизм супрессии зависит от характера супрессибельной мутации. Действие супрессорной мутации может быть связано с включением иного пути синтеза того или иного вещества, а также со снятием ингибирующего действия компонентов, препятствующих функционированию энзимов. В этих случаях супрессорная мутация не влияет на образование продукта, синтезируемого под контролем мутировавшего гена.

Рис. 5. Мутагенез у бактерий (схема): А - ген дикого типа, с которого считывается соответствующая генетическая информация (- - - ->); Б - мутантный аллель, образовавшийся при прямой мутации (х); вставка или выпадение одной пары оснований, вызывающая сдвиг считывания. Правильная информация (- - - ->) считывается только с небольшого участка гена. На остальном протяжении гена считывается искаженная информация (~ ~ ~ ->), в результате чего синтезируется неактивный соответствующий гену белок; В и Г - восстановление правильного считывания в результате супрессорной мутации, то есть изменения, противоположного первичной мутации [вторичное выпадение (x1) при первичной вставке (x) и наоборот]. Расстояние между прямой (х) и супрессорной (x1) мутациями определяет протяженность участка, с которого считывается искаженная информация (~ ~ ~ ->).

Рис. 5. Мутагенез у бактерий (схема): А - ген дикого типа, с которого считывается соответствующая генетическая информация (- - - ->); Б - мутантный аллель, образовавшийся при прямой мутации (х); вставка или выпадение одной пары оснований, вызывающая сдвиг считывания. Правильная информация (- - - ->) считывается только с небольшого участка гена. На остальном протяжении гена считывается искаженная информация (~ ~ ~ ->), в результате чего синтезируется неактивный соответствующий гену белок; В и Г - восстановление правильного считывания в результате супрессорной мутации, то есть изменения, противоположного первичной мутации [вторичное выпадение (x1) при первичной вставке (x) и наоборот]. Расстояние между прямой (х) и супрессорной (x1) мутациями определяет протяженность участка, с которого считывается искаженная информация (~ ~ ~ ->).

Супрессорные мутации другого рода могут полностью или частично восстанавливать активность белка, синтезируемого под влиянием супрессибельного гена. Имеется ряд экспериментальных данных, позволяющих полагать, что супрессия в данном случае связана с восстановлением правильной или обеспечивающей частичную активность последовательности аминокислот в соответствующем белке. Это восстановление происходит на уровне процесса трансляции, то есть построения белков на матрице молекулы РНК в рибосомах.

Известно, что обратное мутирование нередко используется для выяснения характера перестроек ДНК, возникающих при прямых мутациях.

Обязательным условием для использования теста обратных мутаций является установление генетической идентичности обратных мутантов и дикого типа. Только при наличии такой идентичности, то есть при исключении эффекта супрессии, возврат дикого фенотипа может быть отнесен за счет истинной обратной мутации.

Мутации представляют собой конечный эффект процесса мутагенеза. В цепи событий, совокупность которых приводит к закреплению мутационных изменений, первичным является действие мутагена.

В настоящее время общепризнано, что все без исключения мутации причинно обусловлены, то есть возникают под влиянием мутагенных агентов. Разделение мутаций на так наз. спонтанные и индуцированные сохраняется, однако оно носит условный характер. Под спонтанными понимаются мутации, возникающие в бактериальной популяции, не подвергаемой каким-либо специальным воздействиям, под влиянием неконтролируемых мутагенных воздействий (естественная радиация, сдвиги в температуре, рН и составе среды, накопление клеточных метаболитов и т. д.). Мутагенными при этом могут являться как внешние агенты, так и соединения, локализованные внутриклеточно, в частности являющиеся ее естественными метаболитами.

Агенты, проникающие в клетку извне или продуцируемые ею, могут непосредственно повреждать ДНК, то есть служить мутагенами, либо вызывать образование мутагенных соединений и действовать, т. о., опосредованно. Вследствие разнообразия агентов, вызывающих спонтанное мутирование, и различия в механизмах их действия спонтанные мутанты представляют собой различного рода повреждения ДНК: замены пар оснований, делеции, вставки и т. д.

Спонтанная мутабельность обеспечивает накопление мутантов в ходе размножения бактериальной популяции, определяя естественный фон, характеризующий концентрацию того или иного рода мутантов в естественных условиях роста культуры.

При расчете скорости спонтанного мутирования определяется число мутантов по данному гену (признаку) на бактериальную клетку на генерацию. Такое определение может осуществляться в log-фазу роста бактерий, когда большинство клеток популяции делится с равной скоростью.

Существует ряд способов определения скорости (частоты) спонтанного мутирования.

Поразительно на первый взгляд постоянство в частоте спонтанного мутирования относительно большинства изученных признаков. Интересно в этом смысле предположение, согласно которому в процессе эволюции складываются оптимальные для существования вида условия, обеспечивающие, с одной стороны, стабильность генетического материала, а с другой, придающие относительную пластичность виду, то есть обусловливающие возможность приспособления в эволюционном аспекте.

Выражением такого баланса является постоянный уровень мутирования, пределы которого определяются специальными энзиматическими системами, восстанавливающими до определенного предела премутационные изменения ДНК. Такая возможность подтверждается обнаружением подобного рода систем у бактериальных клеток. Эти системы обнаружены в исследованиях с ультрафиолетовыми лучами (УФ). Показано, что восстановлению подвергаются не только прелетальные, но и премутагенные изменения, вызванные УФ. Такое восстановление может, в частности, осуществляться системой темновой реактивации. Функция этой системы обеспечивается активностью ряда энзимов, удаляющих поврежденные участки ДНК, ресинтезирующих соответствующие фрагменты ДНК и интегрирующих вновь образованные участки в геном бактериальной клетки. Высказывались предположения о том, что мутации возникают в процессе указанного восстановления. Такая возможность не может быть полностью исключена и сейчас. Однако очевидно, что даже при мутациях, вызванных УФ, этот механизм не является ведущим. Напротив, система темновой репарации весьма активно восстанавливает премутационные изменения. Свидетельством этого является увеличенный мутагенный эффект УФ относительно радиочувствительных мутантов, лишенных системы темновой реактивации.

Проблема восстановления повреждений ДНК интенсивно разрабатывается в настоящее время. Накопленные к наст, моменту данные свидетельствуют о возможности восстановления повреждений, вызванных не только УФ, но некоторыми другими мутагенными воздействиями. Вместе с тем имеющиеся данные свидетельствуют о наличии различных систем, тем или иным образом участвующих в восстановлении повреждений. Многие из полученных данных еще недоступны объяснению.

Говоря о репарирующих системах, мы коснулись мутаций, вызванных УФ, то есть получаемых искусственным путем. Такого рода мутации называют индуцированными. Индуцирующей активностью обладает ряд химических соединений, а также физических агентов. Механизмы действия мутагенных факторов различны. Некоторые из этих механизмов изучены достаточно детально. Так, например, известно, что мутагенный эффект алкилирующих соединений связан с элиминированием 7-этилгуанина из молекулы ДНК и замещением его некомплементарным для цитозина основанием.

В мутагенном действии УФ определенную роль играет димеризация молекул тимина.

Большой интерес представляет вопрос специфичности мутагенных воздействий. Касаясь этой проблемы, следует рассмотреть ее в разных аспектах. Прежде всего необходимо отметить, что причинная обусловленность мутационных изменений отнюдь не равнозначна адекватности изменений вызвавшему их фактору. Любой мутагенный агент вызывает самые различные изменения в геноме бактерий. Приспособительный характер изменчивости в процессе эволюции определяется естественным отбором, которому подвергаются сформировавшиеся мутанты.

В случае искусственного получения мутаций для отбора определенного класса мутантов создаются соответствующие селективные условия (среды с антибиотиками, фагом и т. д.). Таким образом, случайно возникающие в различных генах мутации представляют собой материал, подвергающийся естественному отбору. Совокупность этих двух процессов (мутации и естественный отбор) приводит к формированию популяций, приспособленных к тем или иным условиям существования.

В исследованиях с бактериофагами установлено, что в пределах одного гена имеются определенные участки (горячие точки), наиболее часто повреждаемые мутагеном. Такие участки обнаружены при использовании каждого изученного мутагена. Отсюда сделан вывод о наличии лишь внутригенной специфичности. Специфичность же относительно отдельных генов отрицается. Подобного рода исследований в отношении бактерий нет.

Принимая во внимание, что ДНК состоит только из четырех нуклеотидов, трудно и теоретически представить себе возможность строго специфического изменения отдельных генов. Однако возможность превалирующего действия относительно отдельных генов не представляется невероятной. Такое предпочтительное действие мутагена, повреждающего определенные основания, может быть связано с нуклеотидным составом соответствующего гену фрагмента ДНК (например, с большим количеством ГЦ- или АТ-пар). Не исключена возможность, что различные мутагены могут иметь различное число "горячих" точек, что приведет к более интенсивной мутабельности отдельных генов при данном мутагенном воздействии.

В литературе описаны отдельные данные об изменении мутабельности, зависящем от генотипа бактерий.

В некоторых случаях повышенная мутабельность связана с присутствием специальных элементов (особого вида эписом, некоторых профагов, генов мутаторов). В других случаях интенсивность мутабельности определяется фрагментом самого гена и может быть передана путем трансформации.

Ограниченный спектр индуцируемых мутаций, по-видимому, может быть получен в случае использования агентов, мутагенная активность которых связана с включением в состав молекулы ДНК. Такая возможность может быть достигнута ограничением времени действия мутагена относительно таких бактерий, репликация хромосомы которых начинается с определенной точки.

В практике получения желаемых мутаций, обладающих селективными преимуществами, могут быть использованы воздействия, увеличивающие общий выход индуцированных мутаций. Применение селективных сред позволит получить более высокий выход желаемых мутационных изменений. Проблема специфичности мутагенных изменений представляет собой наиболее важный, практически значимый раздел учения о мутагенезе. Дальнейшие исследования в этой области, безусловно, являются перспективными и насущно необходимы. См. также Мутагенез (Ежегодник II).

А. Скавронская.