Тайны вирусов

...тысячи лет идет эта тихая невидимая война человека и вирусов...

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

ВИРУСЫ (дополнение к ст. "Вирусы", Ежегодник I).

Репродукция вирусов.

Все известные в настоящее время вирусы являются облигатными клеточными паразитами и их размножение в естественных условиях может протекать только внутри клетки. Несмотря на существенные различия в структуре вирусов и специфические особенности клеток-хозяев, основные закономерности репродукции вирусов имеют много общих черт. Процесс репродукции вирусов начинается с присоединения вирусной частицы к клетке и заканчивается выходом из клетки синтезированного в ней многочисленного вирусного потомства. Схематически этот процесс можно разбить на следующие этапы: 1) адсорбция вируса на клетке; 2) проникновение вирусной нуклеиновой кислоты в клетку и ее высвобождение; 3) перестройка клеточного метаболизма; 4) репликация вирусного генома; 5) синтез вирусных структурных белков; 6) сборка зрелых вирусных частиц; 7) освобождение вирусного потомства из клетки.

Первым этапом взаимодействия вирусов с клеткой является его адсорбция (прикрепление) к клеточной поверхности. Адсорбция происходит в результате случайных столкновений вирусных частиц с клеткой. При этом вирусы фиксируются на особых структурах клеточной поверхности, так наз. клеточных рецепторах. Клеточные рецепторы высокоспецифичны по отношению к типу вирусов. Обработка клеточной поверхности некоторыми химическими веществами приводит к повреждению рецепторов для данного вируса. Утрата клеточных рецепторов может происходить также в результате мутационных изменений клетки. Для ряда вирусов животных и бактерий клеточные рецепторы удалось выделить химическим путем. Показано, что вирусные частицы адсорбируются на изолированных рецепторах. Каждая клетка содержит ограниченное число рецепторов для данного вируса (обычно порядка нескольких сотен).

Способность вирусов адсорбироваться на клетке обусловлена наличием на их поверхности особых химических группировок - вирусных рецепторов. Вирусные рецепторы обладают специфичностью по отношению к инфицируемой клетке. Как и клеточные рецепторы, они могут быть модифицированы или инактивированы химическими воздействиями, а также в результате мутации вируса. В некоторых случаях вирусные рецепторы представляют специальные компоненты вирусной частицы (часть отростка у бактериофагов Т-серии, паразитирующих на бактериях Escherichia coli).

Таким образом, адсорбция вирусов на клетке определяется взаимодействием клеточных и вирусных рецепторов. Основную роль в этом взаимодействии играют электростатические силы. На скорость адсорбции существенно влияют концентрация клеток, химический состав среды (в частности, наличие ионов Mg++ и Са++), рН и ионная сила среды и т. п. Кинетика адсорбции обычно следует уравнению: n=n0e-kNt, где n0 - исходное число вирусных частиц, n - число вирусных частиц, оставшихся неадсорбированными через время t, N - число клеток, k - константа. Адсорбировавшийся вирус вначале может быть элюирован с клетки, то есть на начальной стадии адсорбция обратима. Рецепторы вирусов растений и клеточные рецепторы растений практически не изучены.

Вслед за адсорбцией вируса и клетка претерпевают ряд изменений, в результате которых нуклеиновая кислота вируса освобождается от заключающей ее оболочки и оказывается внутри клетки. С этого момента начинается скрытый период (эклипс) развития вируса, в течение которого инфекционный вирус не обнаруживается при разрушении зараженной им клетки.

Конкретные механизмы высвобождения нуклеиновых кислот существенно различаются для разных вирусов. В случае, например, Т-четных бактериофагов адсорбция сопровождается структурными изменениями нитей отростка - фибрилл. Одновременно происходит высвобождение фагового лизоцима, который разрушает прилегающий участок клеточной стенки. Высвобождающиеся при этом ионы Са++ активизируют аденозинтрифосфатазу сократительного белка чехла отростка. Чехол сокращается и стержнем отростка прорывает цитоплазматическую оболочку клетки. Вслед за тем содержимое фаговой головки - ДНК вместе с незначительным количеством полиаминов и белка - по каналу отростка инъецируется в цитоплазму бактерии. При этом основная часть фагового белка остается снаружи бактериальной клетки и участия в дальнейшей репродукции фага не принимает. Аналогичный способ введения ДНК в клетку, при котором фаговый белок остается снаружи, наблюдался и у ряда других фагов, в том числе у фагов, не снабженных отростком.

У клеток животных существует особый механизм - пиноцитоз, путем которого вирус может проникнуть внутрь клетки. При пиноцитозе клетка захватывает капельки окружающей среды, так что часть поверхностной мембраны оказывается внутри клетки. Вирус, адсорбированный на клетке, в результате пиноцитоза переносится внутрь ее. Такой способ проникновения вируса в клетку носит название впропексиса. Виропексис имеет существенное значение в случае инфекции рядом вирусов (вирус группы оспы, миксовирусы и др.). Ниже приведено несколько характерных механизмов высвобождения нуклеиновых кислот у вирусов животных.

Вирус осповакцины, оказавшись вследствие виропексиса внутри клетки, сразу же подвергается действию клеточных гидролитических ферментов, которые разрушают большую часть белка и фосфолипидов частицы вируса. Это приводит к высвобождению нуклеоида-нуклеопротеида, занимающего центральную часть вирусной частицы. Дальнейшее разрушение нуклеоида и окончательный выход ДНК в цитоплазму клетки осуществляются при помощи особого "раздевающего" фермента, синтез которого кодируется, по-видимому, вирусной ДНК.

Адсорбция миксовирусов на клетках приводит к взаимодействию между их липопротеидными мембранами, в результате которого обе мембраны повреждаются. В этом случае вирус проникает в клетку также вследствие виропексиса, однако ему предшествует частичное разрушение внутри пиноцитической вакуоли.

Адсорбция вируса полиомиелита сопровождается перестройкой структурных белковых субъединиц его оболочки. В результате этого оболочка приобретает чувствительность к протеолитическим ферментам. Идущий одновременно процесс виропексиса переносит модифицированную вирусную частицу внутрь клетки, где и происходит окончательное лизирование ее оболочки и высвобождение вирусной РНК.

Адсорбция вируса на клетке и последующее проникновение вирусной нуклеиновой кислоты приводят к глубоким изменениям в метаболизме клетки-хозяина. Сущность этих изменений сводится к тому, что синтезирующий аппарат клетки перестраивается таким образом, чтобы обеспечить синтезы, требующиеся для репродукции вируса. В результате синтезы соединений, необходимых для нормальной жизнедеятельности клетки, как правило, в той или иной мере подавляются.

В случае инфекции Т-четными бактериофагами уже через несколько минут после адсорбции начинается деградация бактериальной ДНК. Синтезы бактериальных нуклеиновых кислот и белков полностью подавляются. В некоторых случаях инфицирование бактерий не вызывает столь резких изменений клеточного метаболизма. Например, репродукция фага λ, паразитирующего на Е. coli, вообще невозможна без функционирования бактериального генома на протяжении большей части внутриклеточного развития вируса.

Степень нарушения клеточного метаболизма вируса животных существенно варьирует для разных вирусов. Так, размножающийся в ядре клетки ДНК-содержащий вирус герпеса уже в ранней стадии своего развития вызывает сильные изменения структуры клеточного ядра и соответственно нарушения клеточного метаболизма. Другой ДНК-содержащий вирус - вирус осповакцины - не вызывает деградации клеточного ядра. Однако метаболизм клетки и в этом случае претерпевает существенные изменения.

При инфекции ДНК-содержащими вирусами одновременно с подавлением синтезов, кодируемых клеточным геномом, в клетках начинается интенсивный синтез вирусоспецифичных информационных РНК (иРНК). Он осуществляется на вирусной ДНК при помощи предсуществовавшего клеточного фермента - ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Основная масса синтезирующихся в это время иРНК (ранние иРНК) кодирует синтез ферментов, необходимых для репликации вирусной ДНК (ранние ферменты). Синтез этих белков осуществляется при помощи предеуществовавших в клетке компонентов (рибосомы, ферменты, донаторы энергии, sPHK). Репликация вирусной ДНК начинается после лаг-периода, в течение которого в клетке синтезируются все необходимые предшественники ДНК. Синтез вирусной ДНК осуществляется, по-видимому, частично клеточной ДНК-полимеразой, частично ферментом, синтезированным вирусом.

У бактериофагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК (бактериофаг φХ174, паразитирующий на Б. coli), репликации ДНК предшествует образование двухцепочечной молекулы ДНК, так наз. репликативной формы. Участие в репликации ДНК особой репликативной формы, отличной от ДНК зрелого фага, показано в настоящее время и для ряда бактериофагов, содержащих двухцепочечную ДНК (бактериофаги кишечной палочки Т2, λ).

Синтез вирусных ДНК может локализоваться в разных местах клетки. Так, у аденовирусов он локализован в ядре, у вируса группы оспы - в цитоплазме. В последнем случае было показано, что при одновременном инфицировании клетки несколькими вирусными частицами области репликации ДНК каждого вируса пространственно разобщены.

Инфекция большинством РНК-содержащих вирусов приводит к остановке синтеза клеточных белков и нуклеиновых кислот. На модели энтеровирусов было показано, что эта репрессия осуществляется вследствие синтеза под контролем вирусной РНК гистоноподобного белка, а также белка, разобщающего полисомы. В дальнейшем вирусная РНК индуцирует синтез РНК-полимеразы (осуществляющей репликацию молекул вирусной РНК) и структурных белков вирусной корпускулы. Предполагается, что при синтезе этих белков вирусная РНК выступает непосредственно в роли информационной РНК. Если вирусы содержат одноцепочечную РНК, то в репликации РНК принимает участие двухцепочечная форма РНК (репликативная РНК). Местом репликации РНК может являться как ядро клетки (миксовирусы, вирусы табачной мозаики), так и цитоплазма (вирусы полиомиелита) . Репликации вирусной РНК предшествует лаг-период (7 мин. у бактериофага кишечной палочки MS2, 2-2,5 часа у вируса полиомиелита).

Особый случай репликации РНК обнаружен у вируса саркомы Рауса. В репликации РНК этого вируса принимает участие комплементарная ей ДНК, синтез которой индуцируется вирусом в клетке (Темин, 1964).

Механизмы репликации вирусов, содержащих двухцепочечную РНК (реовирус), практически не изучены.

Синтезы структурных белков вирусных частиц обычно следуют за синтезом их нуклеиновых кислот. При этом для некоторых ДНК-содержащих вирусов наблюдается значительный интервал между окончанием синтеза ДНК и началом синтеза структурных белков (35-45 мин. для вирусов осповакцины). Синтез структурных белков осуществляется подобно синтезу ранних ферментов на предсуществовавших рибосомах клетки-хозяина с использованием клеточных ферментов, донаторов энергии, sPHK. В качестве матриц для синтеза выступают либо и РНК, синтезированная на ДНК вируса (у ДНК-содержащих вирусов), либо сама

РНК вируса (у РНК-содержащих вирусов). Синтез может происходить как в ядре (у аденовируса), так и в цитоплазме (у вирусов осповакцины, полиомиелита). Известны и более сложные случаи, когда часть белков синтезируется в ядре, а часть - в цитоплазме (у миксовирусов). Синтезы вирусных структурных белков и нуклеиновых кислот часто пространственно разобщены. Например, РНК вируса энцефаломиокардита реплицируется в ядре, а структурный белок этого вируса синтезируется в цитоплазме. Общая схема синтеза вирусных макромолекул представлена на рис. 1.

Таким образом, появлению зрелых вирусных частиц предшествует создание внутриклеточного фонда вирусных нуклеиновых кислот и структурных белков. Важно отметить, что между молекулами нуклеиновых кислот, находящимися в фонде, могут происходить обмены частями молекул. Благодаря этому в клетке, одновременно инфицированной несколькими мутантными формами одного вируса, возможно появление рекомбинантных вирусных форм.

Рис. 1. Общая схема синтеза вирусных макромолекул: 1 - в незаряженной клетке; 2 - при репродукции ДНК-содержащих вирусов; 3 - при репродукции РНК-содержащих вирусов.

Рис. 1. Общая схема синтеза вирусных макромолекул: 1 - в незаряженной клетке; 2 - при репродукции ДНК-содержащих вирусов; 3 - при репродукции РНК-содержащих вирусов.

Входящие в состав некоторых вирусных частиц липиды и полисахариды не кодируются вирусным геномом, а поставляются клеткой.

Сборка вирусных частиц из синтезированных компонентов, по-видимому, в ряде случаев протекает как спонтанная агрегация и ее можно воспроизвести in vitro в смеси изолированных компонентов (вирусы табачной мозаики).

У некоторых сложноорганизованных вирусов определяющая роль в морфогенезе принадлежит нуклеиновой кислоте. Так, морфогенез Т-четных бактериофагов начинается с конденсации ДНК в компактную структуру (рис. 2). Вокруг этой структуры "кристаллизуются" субъединицы белковой оболочки фага. К образовавшейся головке фага спонтанно присоединяются элементы отростка, и этим завершается процесс образования зрелой фаговой частицы.

У вирусов животных, имеющих внешнюю оболочку (вирусы осповакцины), морфогенез протекает значительно сложнее и в нем принимают участие клеточные структуры.

С появлением внутри инфицированной клетки первых зрелых вирусных частиц заканчивается стадия эклипса. Через некоторое время после этого вирусные частицы начинают появляться во внеклеточном пространстве. Высвобождение их из клетки может происходить различными способами. Иногда клетки, содержащие некоторое число созревших вирусных частиц, разрушаются, и все вирусное потомство одновременно оказывается во внеклеточной среде (Т-четные фаги, вирусы полиомиелита). В некоторых случаях вирус может выходить в среду задолго до клеточного лизиса. Более того, клетки, высвобождающие вирус во внешнюю среду, могут длительное время нормально функционировать (вирус гриппа, некоторые малые бактериофаги).

Рис. 2. Последовательные стадии формирования Т-четных бактериофагов.

Рис. 2. Последовательные стадии формирования Т-четных бактериофагов.

Время от начала инфицирования клетки до выхода из нее первых зрелых вирусов носит название латентного периода развития вируса. Величины латентных периодов у некоторых вирусов представлены в таблице. В этой же таблице представлена численность потомства вирусной частицы, синтезированного одной инфицированной клеткой.

Описанный выше способ репродукции вирусов носит название вирулентного, или литического, цикла репродукции. У так наз. умеренных вирусов существует способ репродукции, принципиально отличающийся от вирулентного цикла. При определенных условиях генетический материал умеренного вируса, проникнув в клетку, присоединяется (интегрируется) к клеточному геному и в дальнейшем размножается в его составе. Генетические функции вирусного генома при этом оказываются репрессированными (подавленными), и клетка может многократно пассироваться, не репродуцируя вирус (лизогенное состояние клетки). Дерепрессия генетических функций вирусного генома (индукция) может происходить либо спонтанно (в малой части клеточной популяции), либо в результате определенных воздействий на клетку (облучение рентгеновыми или ультрафиолетовыми лучами, обработка различными химическими веществами). Индукция приводит (после некоторого лаг-периода) к последовательности явлений, аналогичной той, которая наблюдается при вирулентном цикле репликации. Она заканчивается гибелью клетки и высвобождением вирусного потомства. Полученные в последние годы данные указывают, что злокачественная трансформация клеток онкогенными вирусами (вирус полиомы, вирус SV40), возможно, является результатом их лизогенизации.

Размножение вирусов в клетках сопровождается более или менее четко выраженными цитопатическими эффектами. Эти эффекты проявляются при размножении вирусов как в клетках живого организма, так и в клетках культуры ткани, культивируемой in vitro. Можно указать три наиболее характерных типа цитопатического действия вирусов: а) заражение вирусом вызывает полное разрушение инфицированных клеток (вирус полиомиелита - клетки HeLa); б) зараженные клетки округляются, увеличиваются в объеме, теряют способность к делению и погибают (аденовирус - клетки HeLa); в) морфологические нарушения отсутствуют, инфицированные клетки делятся, давая нежизнеспособные клетки (вирус гриппа - клетки куриных фибробластов).

Таблица. Латентные периоды и выход вируса.

Таблица. Латентные периоды и выход вируса.

Е. Голуб.

Мутагенез вирусов человека и животных.

Мутации у вирусов человека и животных, как и у других организмов, могут возникать в естественных условиях размножения, а также при воздействии на вирус мутагенными факторами.

Мутации в естественных условиях размножения. Частота возникновения мутаций по определенному генетическому признаку в процессе естественного размножения вирусов человека и животных неодинакова как для отдельных генетических признаков, так и для различных штаммов вирусов. Примером высокомутирующего гена может явиться так наз. U-признак вируса оспы коров.

У штаммов этого вируса, образующих геморрагические поражения на хорион-аллантоисной оболочке (ХАО) куриного эмбриона (U+-признак), возникают белые негеморрагические поражения (U- типа) с частотой от 1:102 до 1:103 [Дауни, Хаддокк (A. Downie, D. Haddock)]. Вместе с тем ряд признаков мутирует весьма редко, например устойчивость вируса гриппа к β-ингибиторам нормальной сыворотки изменяется при естественных условиях размножения с частотой 7:109 [Медилл-Браун, Брайоди (М. Medill-Brown, B. Briody)]. Разная частота мутаций по определенному генетическому признаку у различных штаммов одного и того же вируса была показана, например, для "гуанидинового" признака (чувствительность к гуанидину) у вируса полиомиелита: от 3,8:106 до 7,5:108 (Карп (Р. Carp)].

Индуцированный мутагенез.

У вирусов человека и животных удается вызывать возникновение мутаций при обработке внеклеточного и размножающегося в клетке вируса, а также при непосредственной обработке мутагенами нуклеиновой кислоты. В опытах с нативным внеклеточным вирусом удалось наблюдать возникновение мутаций при обработке рентгеновыми лучами вируса везикулярного стоматита, облучении ультрафиолетовыми лучами вируса оспы кроликов, обработке этилэтансульфонатом и диметилсульфатом вируса болезни Ньюкасла, гидроксиламином вируса полиомиелита и болезни Ньюкасла. Наиболее часто возникали мутации при обработке нативного вируса азотистой кислотой (вирус полиомиелита, ECHO, энцефаломиокардита, Синдбис, болезни Ньюкасла, псевдобешенства, полиомы). В опытах с внутриклеточными вирусами возникновение мутаций чаще наблюдается при действии на вирус ультрафиолетовых лучей (опыты с вирусами полиомиелита, клещевого энцефалита, западного лошадиного энцефаломиелита, чумы птиц). Мутации также возникали при обработке формальдегидом внутриклеточного вируса западного лошадиного энцефаломиелита, 1,4-бисдиазоацетилбутаном и N-нитрозометилмочевиной вируса клещевого энцефалита, при добавлении в среду аналогов оснований 5-фторурацила и 5-бромурацила в опытах с вирусом полиомиелита и клещевого энцефалита и 5-бромдезоксиуридина и 2-аминопурина в опытах с вирусом оспы кроликов. В последние годы показана возможность индукции мутаций при непосредственной обработке мутагенами изолированных вирусных нуклеиновых кислот, причем результаты были получены как в опытах с РНК-, так и ДНК-содержащими вирусами. Мутации возникали при обработке нуклеиновых кислот вирусов ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком, гидроксиламином, формальдегидом, азотистой кислотой, при выдерживании в кислой среде, при повышенной температуре и при действии профлавина и света.

Следует отметить, что при обработке вирусов мутагенами возникновение мутаций наблюдается далеко не всегда. Чаще всего неудачи возникают при обработке мутагенами нативного внеклеточного вируса. С другой стороны, при непосредственном действии мутагенов на изолированную вирусную нуклеиновую кислоту удается наблюдать возникновение мутаций при использовании таких мутагенов, которые не индуцируют мутаций при обработке нативного внеклеточного или внутриклеточного вируса.

Для вируса человека и животных не разработано пока эффективных систем (какими, например, располагают исследователи, изучающие бактериофаги), допускающих точный количественный анализ возникающих мутаций, особенно при низкой частоте их возникновения. Чаще всего в опытах с вирусом человека и животных мутации изучают по изменению размера или характера бляшек, образуемых вирусами на культуре ткани под агаром (рис. 3) или на ХАО куриного эмбриона. В последнее время стали также изучать возникновение условно летальных мутантов, не способных размножаться в условиях супраоптимальной температуры. Кроме того, опыты по индуцированному мутагенезу проводили при анализе таких генетических признаков, как способность размножаться на нечувствительных клетках, характер и степень цитопатических изменений клеток культуры ткани, устойчивость к сульфату декстрана и пр.

Обычно при обработке мутагенами вирусов человека и животных происходит изменение какого-либо одного генетического признака, однако имеются работы, в которых показано, что может иметь место изменение нескольких генетических признаков одновременно (например, опыты с азотистой кислотой и профлавином). В ряде случаев при обработке вирулентных штаммов вирусов мутагенами, особенно при непосредственном действии мутагенами на вирусную нуклеиновую кислоту, удается наблюдать возникновение мутантов, часть из которых обладает свойствами вакцинных вирусов.

Изучение индуцированного мутагенеза вирусов человека и животных позволило выявить определенную межгенную специфичность действия мутагенов. Так, в опытах с вирусом болезни Ньюкасла было обнаружено, что мутанты, обладающие повышенной чувствительностью к ингибиторам агара, а также слабой гемагглютинирующей активностью, возникали как при обработке вируса гидроксиламином, так и азотистой кислотой; в то же время мутанты, образующие мелкие бляшки, возникали только при обработке вирусов гидроксиламином [Тири (L. Thiry)]. При сравнительном изучении межгенной специфичности действия ряда мутагенов при непосредственной обработке РНК вируса полиомиелита было обнаружено, что гидроксиламин вызывал наиболее частые изменения S-признака, формальдегид-rct40-признака, а профлавин - Ag-признака (Ю. 3. Гендон). В то же время не удалось обнаружить определенной взаимосвязи между химической специфичностью взаимодействия мутагена с определенным основанием нуклеиновой кислоты и специфичностью мутаций в их фенотипическом проявлении.

Рис. 3. Различный характер бляшек - мутные (1) и прозрачные (2), образованных на культуре ткани фибробластов куриного эмбриона под агаром вирусами группы оспы.

Рис. 3. Различный характер бляшек - мутные (1) и прозрачные (2), образованных на культуре ткани фибробластов куриного эмбриона под агаром вирусами группы оспы.

О внутригенной специфичности действия мутагенов работ практически нет из-за отсутствия систем, позволяющих изучать этот вопрос.

В опытах с вирусами человека и животных не проводилось столь глубокого изучения молекулярных механизмов возникновения мутаций, как в опытах с бактериофагами и некоторыми вирусами растений. Однако имеющиеся данные позволяют считать, что молекулярные механизмы возникновения мутаций при обработке мутагенами вирусов человека и животных принципиально те же, что и при действии мутагенов на бактериофаги или вирусы растений.

Ю. Гендон.