Тайны вирусов

...тысячи лет идет эта тихая невидимая война человека и вирусов...

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ВИРУСОВ

Инфекционностью нуклеиновых кислот называют способность нуклеиновых кислот вирусов вызывать в клетках хозяина специфический инфекционный процесс с образованием полноценных вирусных частиц. Инфекционность нуклеиновых кислот определяется их генетической функцией. Заключая в специфической последовательности нуклеотидов генетическую информацию для своего воспроизведения и синтеза других компонентов вирусных частиц, нуклеиновые кислоты тем самым детерминируют возникновение и развитие вирусной инфекции. Нуклеиновые кислоты как материальный носитель наследственности у вирусов отождествляется с химической основой их инфекционности. В этом смысле нуклеиновые кислоты всех вирусов следует считать инфекционными. Но в научной терминологии значение понятия инфекционная нуклеиновая кислота обычно суживается - его принято относить только к препаратам изолированных из вирусов нуклеиновых кислот Воспроизведение инфекционности нуклеиновых кислот бактериофагов обозначается также термином "трансфекция" [Фельдеш, Траутнер (I. Foldes, Т. Trautner), 1964].

Благодаря доказательству генетической роли ДНК в опытах трансформации бактерий, демонстрации избирательного проникновения ДНК бактериофага при инфекции бактерии и, наконец, теоретической возможности кодирования аминокислот в белках разными сочетаниями нуклеотидов в молекуле ДНК была обоснована идея отождествления материальных носителей наследственности микроорганизмов исключительно с нуклеиновой кислоты. Логическим завершением этой идеи и ее прямой экспериментальной проверкой явились опубликованные в 1956 г. работы Френкель-Конрата (Н. Fraenkel-Conrat, 1956) в США и независимо от него Гирера и Шрамма (A. Gierer, G. Schramm, 1956) в ФРГ по воспроизведению вируса мозаичной болезни табака (ВТМ) при помощи изолированной из вируса РНК. Эти работы впервые показали, что свободная нуклеиновая кислота вируса обладает инфекционностью - вызывает в зараженных листьях характерные для интактного вируса поражения и синтез полноценных частиц ВТМ.

Вслед за РНК ВТМ удалось установить инфекционность изолированных РНК ряда вирусов человека, животных и растений. Попытки выделить инфекционные ДНК бактериофагов до 1960 г. оставались безуспешными. Из вирусов бактерий первые удачные опыты, проведенные почти одновременно в нескольких лабораториях, относятся к воспроизведению инфекционности одно-цепочечной ДНК мелкого кишечного фага 0X174 [Гатри, Синсхаймер (G. D. Gut-brie, R. L. Sinsheinier), 1960]. Вслед за этим удалось продемонстрировать инфекционность значительно более крупных двухцепочечных макромолекул ДНК, выделенных из группы средних по величине бактериофагов λ, Т1 и Т7. В дальнейшем при использовании в качестве реципиентов трансформабильных видов бактерий и при исключении неблагоприятных для нуклеиновых кислот гидродинамических воздействий были изолированы с сохранением инфекционных свойств и наиболее крупные среди известных для фагов макромолекулы ДНК. Общее количество выделенных в настоящее время инфекционных нуклеиновых кислот вирусов приближается к 50. Из группы вирусов человека и животных во многих случаях инфекционность нуклеиновых кислот показана только для экстрактов тканей, инфицированных вирусами.

Методы выделения инфекционных нуклеиновых кислот предусматривают сочетание эффективной депротеинизации вируса с сохранением высокополимерной нативной структуры молекул нуклеиновых кислот. Наиболее распространенным методом, удовлетворяющим в той или иной степени этим условиям, является экстракция водонасыщенным фенолом. Кратковременные экстракции суспензии вируса равным объемом водонасыщенного фенола обеспечивают депротеинизацию большинства из известных ДНК- и РНК-содержащих вирусов, в процессе экстракции вирусные и другие белки, в том числе нуклеазы, денатурируются, растворяются в феноле или собираются на границе раздела с водной фазой. Водную фазу с перешедшей в нее нуклеиновой кислотой отделяют центрифугированием и экстрагируют новой порцией фенола, повторяя эти циклы до полного исчезновения слоя денатурированного белка на границе раздела водной и фенольной фаз. В заключение нуклеиновые кислоты очищают от остатка фенола либо диализом, либо повторными экстракциями эфиром, а эфир испаряют продуванием газообразного азота. В других случаях прибегают к переосаждению нуклеиновых кислот из водной фазы спиртом. Существуют разнообразные модификации фенольного метода, касающиеся температурного режима депротеинизации, изменения рН раствора фенола и применения для этой цели различных буферных систем, комбинирования с действием липофильных анионов, комплексообразующих агентов, детергентов, которые повышают выход инфекционных нуклеиновых кислот и с успехом приложимы для их экстракции из инфицированных вирусами тканей животных.

Детергентный метод изоляции инфекционных нуклеиновых кислот технически более трудоемок. Он находит ограниченное применение и в связи с устойчивостью ряда вирусов к действию детергентов.

В последнее время на ряде бактериофагов испытан простой и эффективный способ изоляции нуклеиновых кислот высококонцентрированными растворами NaClO4. Перспективным в этом отношении может также оказаться метод выделения с помощью ферментов типа проназы, избирательно разрушающих белковый капсид вирусной частицы.

Несмотря на очевидные успехи, проблема выделения инфекционных нуклеиновых кислот вирусов решена далеко не полностью. Теоретически можно полагать, что если ДНК и РНК не нуждаются в белковом компоненте вирусной частицы для начала репликации, то нуклеиновые кислоты всех вирусов должны обладать инфекционностью в изолированном состоянии. Между тем инфекционная нуклеиновая кислота выявлена пока только у сравнительно малочисленной группы вирусов и в некоторых случаях воспроизводится непостоянно. Разноречивы данные об инфекционности РНК вируса гриппа, не подтверждены данные на нуклеиновые кислоты вируса Сендай и аденовируса типа 3. Среди штаммов вируса ньюкаслской болезни инфекционная РНК воспроизводится только у индийской разновидности вируса. В преодолении подобного рода трудностей должны учитываться индивидуальные особенности молекулярной структуры нуклеиновых кислот. Имеются также указания на роль индивидуальных особенностей штаммов вирусов и на неучитываемые нюансы применяемых методов для выделения инфекционных нуклеиновых кислот. У вируса гриппа инфекционную РНК чаще выделяют из свежевыделенных штаммов, а предварительная обработка вируса эфиром повышает вероятность изоляции активного препарата. Инфекционную РНК вируса западного лошадиного энцефаломиелита удается экстрагировать только горячим фенолом, а экстракция на холоду неэффективна. Непрерывный прогресс фнзико-химии нуклеиновых кислот и совершенствование техники их выделения будут способствовать открытию все большего количества новых инфекционных РНК и ДНК вирусов.

Идентификация инфекционной нуклеиновой кислоты основывается на следующих критериях: 1) полной инактивации ДНК-азой или РНК-азой, а во многих случаях и другими нуклеазами; 2) устойчивости к протеолитическим ферментам; 3) отсутствии нейтрализации лишенной нуклеазной активности иммунной сывороткой к интактному вирусу; 4) отличной от вируса скорости седиментации, совпадающей или близкой с константой седиментации данной полимерной нуклеиновой кислоты; 5) как правило, более выраженной, чем у интактного вируса, терморезистентности; 6) сохранении инфекционности в процессе переосаждения спиртом при условии инактивации интактного вируса; 7) присущей данной нуклеиновой кислоте плотности при центрифугировании; 8) возможности заражения некоторых нечувствительных к вирусу клеток; 9) характерном для нуклеиновой кислоты спектре поглощения и соотношении содержания азота и фосфора; 10) отсутствии заметных количеств белка; 11) электронно-микроскопическом обнаружении молекул нуклеиновой кислоты и исключении неразрушенных вирусных частиц.

Далеко не все известные препараты инфекционных нуклеиновых кислот были испытаны по всем тестам. В связи с этим некоторые исследователи высказывали критические замечания, объясняя инфекционность препаратов нуклеиновых кислот участием белка или присутствием интактных и частично поврежденных вирусных частиц. Прямые определения показали, что содержание нативного вирусного белка в препаратах инфекционной РНК ВТМ, выделенной фенольным пли детергентным методом, по данным серологических тестов, не превышает границы чувствительности методов, то есть менее 0,02%. Анализ аминокислот в гидролизатах этих препаратов указывает, что они не входят в состав вирусного белка. Современная препаративная техника, включающая центрифугирование в градиенте плотности, позволяет выделять в высшей степени очищенные препараты, которые исключают роль любых примесей в инфекционной нуклеиновой кислоты. Препараты инфекционных нуклеиновых кислот постоянно содержат варьирующие количества ионов Cu, Са, Mg, Fe и некоторых других металлов и, возможно, образуют с ними комплексы.

Выявление инфекционных нуклеиновых кислот вирусов растений и животных в эксперименте обычно осуществляют при помощи тех же методов, которые применяются для культивирования соответствующих интактных вирусов. Заражение изолированными РНК вирусов растений достигается нанесением их на поверхность предварительно мацерированных листьев. По результатам подсчета очагов поражений в серии последовательных разведений нуклеиновых кислот определяют ее инфекционный титр. Инфекционные нуклеиновые кислоты вирусов животных и человека в зависимости от видовой принадлежности и тропизма вируса чаще всего выявляют либо в однослойных культурах тканей, либо на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов. В обоих случаях наличие инфекционной нуклеиновой кислоты приводит к формированию локальных пораженных участков. Во многих случаях инфекционную нуклеиновую кислоту определяют на лабораторных животных. Изолированные нуклеиновые кислоты бактериофагов не инфицируют интактные клетки нетрансформабельных видов бактерий. Для их заражения необходимо предварительное повреждение клеточной стенки в результате частичного гидролиза мукополимера клеточной стенки лизоцимом или нарушения синтеза ее компонентов под влиянием пенициллина или глицина. Формирующиеся при этом так наз. сферопласты достаточно стабильны в гипертонической среде и могут инфицироваться молекулами нуклеиновой кислоты. Более эффективным способом, однако пригодным лишь для нуклеиновых кислот ограниченной группы умеренных кишечных фагов, является применение фага-помощника без преобразования бактерий в сферопласты. Имеются указания на возможность воспроизведения инфекционной ДНК фага в тестообразной массе разрушенных бактерий. Заражение изолированными нуклеиновыми кислотами фагов трансформабельных видов бактерий при условии компетентного состояния реципиента не требует дополнительной обработки клеток. Проникновение в клетку изолированной нуклеиновой кислоты фага приводит к развитию продуктивной инфекции и завершается, как и при естественном заражении, лизисом клетки.

Инфицирование изолированными нуклеиновыми кислотами предъявляет в целом дополнительные и повышенные требования по сравнению с заражением интактными вирусами. Воспроизведение инфекционной РНК вирусов растений зависит от сезонности и физиологического состояния хозяина, а для нуклеиновых кислот вирусов животных часто решающее значение имеет выбор не только вида восприимчивого животного, но и способа заражения. Инфекционный титр нуклеиновых кислот во многом определяется солевым составом растворителя, его концентрацией и рН. Заражение сферопластов бактерий ДНК фагов обязательно требует наличия в среде альбумина, тогда как на системе с фагом-помощником, а также для РНК фагов альбумин излишен. Среди нуклеиновых кислот фагов известны примеры, когда условия заражения и последующего развития инфекции существенно различаются. Индивидуальность в подборе условий для заражения нуклеиновых кислот определяется их большей чувствительностью по сравнению с вирусами ко многим неблагоприятным факторам и особенно к нуклеазам тканей и клеток. Последний фактор играет основную роль и в инактивации при хранении растворов РНК многих вирусов. Тем не менее при подборе оптимальных условий и соблюдении стандартной методики эксперимента инфекционность нуклеиновых кислот характеризуется хорошо воспроизводимыми количественными показателями.

Количественная оценка инфекционности нуклеиновых кислот характеризуется понятием эффективности инфекции - соотношения инфекционности эквивалентных количеств свободной нуклеиновой кислоты и нуклеиновой кислоты, содержащейся в интактных вирусных частицах. Эффективность инфекции нуклеиновой кислоты большинства растительных и животных вирусов составляет в среднем 0,1-1%. На некоторых растениях инфекционность РНК ВТМ достигает даже 10%. Наивысшие показатели эффективности инфекции для нуклеиновых кислот бактериофагов не превышают 0,01%, а для некоторых ДНК фагов составляют лишь 10-7--9. Выявляемая низкая инфекционность нуклеиновых кислот, по-видимому, не соответствует действительному количеству выделяемых из вируса инфекционных молекул. На это указывают различия в эффективности инфекции одного и того же препарата нуклеиновых кислот при испытании на разных хозяевах. Фракция молекул, оцениваемых физико-химическими и электронно-оптическими методами как нативная, всегда составляет значительную часть препарата нуклеиновых кислот. Более того, возрастание инфекционности реконструированного вируса до 50-80% от активности исходного в процессе реполимеризации вирусного белка с низкоинфекционной РНК ВТМ прямо доказывает ее высокую потенциальную инфекционность. По-видимому, низкий уровень выявляемой инфекционности нуклеиновых кислот определяется действием клеточных нуклеаз в процессе заражения.

Механизм инфицирования изолированными нуклеиновыми кислотами изучен недостаточно. Неоспоримо доказано, что инфицирование реализуется при попадании в клетку только структурно неповрежденных молекул нуклеиновых кислот. Лишь в отношении очень крупных молекул ДНК некоторых фагов сенной палочки допускается возможность воспроизведения инфекционности путем внутриклеточной рекомбинации фрагментированных молекул. Для инфекции нуклеиновых кислот бактериофагов достаточно единичной молекулы. Развитие локального поражения при инфицировании РНК вирусов растений требует определенной критической концентрации нуклеиновых кислот. Первым этапом инфекции нуклеиновых кислот является фиксация молекул на поверхности клетки-хозяина. Молекулы нуклеиновых кислот не имеют специфических рецепторов для прикрепления к клетке, свойственных интактным вирусам, и при случайном соприкосновении с ней удерживаются, как полагают, электростатическими и другими силами притяжения. Отсутствие рецептора определяет возможность заражения нуклеиновых кислот нечувствительных к вирусам клеток, зачастую генетически весьма отдаленных от вида естественного хозяина. Имеются указания на инфицируемость сферопластов кишечной палочки ДНК вируса оспы и РНК вируса энцефаломиокардита, бактерий сенной палочки ДНК вирусов полиомы и оспы, листьев табака ДНК фага fd. До начала внедрения молекулы нуклеиновых кислот ассоциированы с клетками непрочно и обратимо, но это состояние недолговременно. Проникновение инфицирующих молекул нуклеиновых кислот фагов начинается немедленно вслед за их фиксацией. Продолжительность инвазии молекул в стандартных условиях сравнительно постоянна и для нуклеиновых кислот разных вирусов бактерий составляет от 55-80 сек. до 60 мин. Линейные молекулы ДНК фагов проникают в клетку в строго ориентированном состоянии только с одного конца. Инфицирование изолированной нуклеиновой кислотой не является пассивным просачиванием через поверхностные структуры клетки, но сопровождается поглощением энергии. Энергетические затраты клетки при этом согласуются с представлением об активном поглощении ею инфицирующих молекул, то есть именно клетке, а не нуклеиновой кислоте принадлежит основная роль в осуществлении процесса инвазии.

Вследствие того, что заражение нуклеиновые кислоты вирусов растений и животных исключает начальные процессы инфекции, связанные с внутриклеточным освобождением нуклеиновой кислоты от белкового компонента вирусных частиц, латентный период инфекционного процесса оказывается значительно короче. Последующее развитие инфекции и воспроизведение вируса не имеют заметных отличий от естественного заражения интактным вирусом. Это подтверждается и обширными материалами по изучению свойств потомства вируса, репродуцированного в зараженных нуклеиновой кислотой клетках. Потомство вируса всегда сохраняет все генетические признаки того штамма, из которого выделяют нуклеиновую кислоту.

Современные аспекты разработки проблемы инфекционности нуклеиновых кислот связаны с кардинальными вопросами в биологии. Открытие инфекционности нуклеиновых кислот сыграло выдающуюся роль в идентификации материальной основы наследственности. Одна из важных современных задач заключается в раскрытии на инфекционных нуклеиновых кислотах тонкого молекулярного строения генома вирусов. В сочетании с тестом инфекционности физико-химические исследования дают возможность установить структурные особенности генетически полноценных молекул нуклеиновых кислот. Использование подобного методического приема позволило установить одноцепочечное строение ДНК мелкого кишечного фага θХ174 и некоторых других мелких фагов [Файерс, Синсхаймер (W. Fiers, R. Sinsbeimer), 1962], а также двухцепочечной ДНК вируса полиомы. На препаратах инфекционных нуклеиновых кислот представляется возможным выяснить механизм, с помощью которого молекулы замыкаются в кольца, установить функциональные различия обеих полинуклеотидных цепей молекул. На основе инфекционности открывается перспектива расшифровки последовательности нуклеотидов в генах, физической изоляции отдельных генов. Показательны в этом отношении исследования на инфекционной ДНК фага X, для которой уже удалось ориентировать генетические метки по терминальным нуклеотидам молекулы и изолировать концевые гены [By, Кайзер (R. Wu, A. Kaiser), 1967).

Не менее важное значение имеет инфекционность в исследовании механизма внутриклеточной репликации нуклеиновых кислот вирусов. По тесту инфекционности удается проследить все внутриклеточные молекулярные преобразования инфицирующей молекулы нуклеиновой кислоты.

С помощью феномена инфекционности открыты реплицирующиеся формы нуклеиновых кислот вирусов, установлена двухцепочечная структура реплицирующихся молекул одноцепочечных ДНК и РНК, показано образование замкнутых ковалентной связью кольцевых молекул при репликации некоторых линейных двухцепочечных ДНК. Попытки воспроизвести инфекционную нуклеиновую кислоту в ферментативных синтезирующих системах до последнего времени оставались безуспешными. Недавно на матрицах инфекционных одноцепочечных ДНК и РНК фагов путем ферментативного синтеза удалось воссоздать инфекционные двухцепочечные молекулы. Перспектива ближайшего будущего - воспроизведение ферментативным путем полного цикла синтеза вирусных нуклеиновых кислот. Инфекционные нуклеиновые кислоты нашли широкое применение и в исследованиях по белковому синтезу в открытых клеточных системах. В присутствии РНК ВТМ и некоторых мелких фагов в экстрактах клеток успешно синтезированы вирусные белки и антигены, входящие в состав капсидов. Наличие инфекционных нуклеиновых кислот создало возможность исследований в условиях, близких к естественным, и внесло существенную корреляцию в первоначальные представления. Все это служит реальной предпосылкой для воспроизведения в недалеком будущем простейших вирусов.

Не менее перспективно применение инфекционных нуклеиновых кислот для выяснения механизмов мутаций и инактивирующего действия ДНК- и РНК-тропных физических и химических факторов. Описанные структурные нарушения нуклеиновых кислот, возникающие при действии ионизирующей и ультрафиолетовой радиации, ультразвука, температуры, рН, химических мутагенов и других агентов, в действительности далеко не всегда отражают сущность тех изменений, с которым и связана биологическая инактивация, поскольку они обычно регистрируются при дозах во много раз больших, чем требуется для инактивации инфекционной нуклеиновой кислоты. Только в сочетании с инфекционностью возможно раскрыть те тонкие физические и химические нарушения, которые лежат в основе биологической инактивации, связанной с действием на нуклеиновую кислоту. На этом принципе удалось оценить значение димеризации пиримидинов и фотопревращений одиночных оснований в биологической инактивации некоторых ДНК фагов ультрафиолетовыми лучами, уточнить механизм прямой и косвенной инактивации ионизирующего излучения, изыскать способы защиты нуклеиновой кислоты от излучений. Выдающимся по значению открытием явилось установление связи возникновения мутаций с дезаминированием РНК ВТМ [Гирер, Мандри (А. Gierer, К. Mundry), 1958]. Воспроизведение мутагенеза на инфекционных нуклеиновых кислот уже в настоящее время приобретает большое прикладное значение для изыскания новых вакцинных штаммов вирусов (Ю. 3. Гендон, 1967).

Еще один аспект проблемы пока не исследован, но, возможно, очень важен - роль инфекционных нуклеиновых кислот как самостоятельного этиологического фактора некоторых инфекционных заболеваний.

Существование свободных от белка мутантов, представляющих собой одну нуклеиновую кислоту, показано для ВТМ и вируса погремковости табака. Вирус инфекционного гепатита человека, по некоторым данным, также обладает свойствами нуклеиновой кислоты.

Б. Ильяшенко.