Тайны вирусов

...тысячи лет идет эта тихая невидимая война человека и вирусов...

  • Увеличить размер шрифта
  • Размер шрифта по умолчанию
  • Уменьшить размер шрифта

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ГРИППА

Преследует цель подтвердить вирусную природу заболевания и определить тип и разновидность вызвавшего его вируса. Это осуществляется посредством:

а) выделения от больного вируса-возбудителя;

б) определения наличия сдвига противогриппозных антител в сыворотке переболевшего гриппом;

в) обнаружения специфических изменений пли вирусного антигена в мазках-отпечатках, полученных от больных.

Для выделения возбудителя исследуют носоглоточную слизь, получаемую протиранием задней стенки глотки ватным тампоном пли прополаскиванием глотки физиологическим раствором. Предназначенный для исследования материал транспортируют на холоде, исследуют сразу или хранят в замороженном виде при t° -20°, -70°. Для подавления присутствующей в смыве бактериальной флоры материал перед исследованием обрабатывают антибиотиками (400 ЕД пенициллина, 0,4 мг стрептомицина на 1 мл).

Изоляцию вируса из материала проводят путем заражения восприимчивых животных (хорьков, белых мышей, крыс), куриных зародышей или культур тканей (культуры почек эмбрионов человека, почек обезьян). Заражение 10-11-дневных куриных зародышей - наиболее распространенный и чувствительный метод изоляции вируса гриппа. Материал вводят в амниотическую полость при помощи шприца. Зараженные зародыши инкубируют 48-96 час. при t° 35-33°, затем вскрывают. Амниотическую и аллантоисную жидкости исследуют на присутствие вируса при помощи реакции гемагглютинации и используют для повторных пассажей с целью идентификации выделенного вируса. Культуры тканей менее чувствительны для выделения вирусов гриппа.

Рис. 4-6. Изменения слизистой оболочки мягкого неба при гриппе: рис. 4 - первый-второй день болезни; рис. 6 - третий-четвертый день болезни, рис. 6-7-8 день болезни.

Рис. 4-6. Изменения слизистой оболочки мягкого неба при гриппе: рис. 4 - первый-второй день болезни; рис. 6 - третий-четвертый день болезни, рис. 6-7-8 день болезни.

Присутствие вируса в культурах тканей обнаруживают по феномену гемадсорбции (приклеивание внесенных в культуру эритроцитов к клеткам), а идентифицируют - по способности той или иной иммунной сыворотки предотвращать появление гемадсорбции, вызванной вирусом.

Во всех случаях, независимо от метода изоляции вируса, диагноз считается подтвержденным вирусологически только в том случае, если полученный штамм вируса может быть сохранен в лабораторных условиях и идентифицирован, а у больного, от которого он выделен, есть прирост антител к выделенному штамму. Определение сдвига противогриппозных антител в сыворотке крови переболевших - надежный, хотя и ретроспективный, метод лабораторной диагностики гриппа. В силу широкого распространения гриппозной инфекции среди населения в крови детей старше 3 лет и взрослых обычно содержатся противогриппозные антитела, поэтому однократное исследование сывороток на уровень антител не может дать достоверных результатов. Исследуют одновременно две пробы сывороток: одну, взятую в остром периоде заболевания, другую - 10-20 дней спустя. Подготовленные сыворотки разводят с двукратным коэффициентом от 1:10 до 1:1280 и каждое разведение смешивают с определенной дозой вируса или вирусного антигена; смесь оставляют на время, необходимое для взаимодействия антитела и антигена, а затем устанавливают титр сыворотки, т. е. предельное разведение, оказавшееся эффективным. Диагностически достоверными считаются те случаи, когда в сыворотке, взятой после выздоровления, титр антител к тому или иному типу и штамму вируса гриппа повысился не менее чем в 4 раза.

В соответствии с тремя типами антител, образующихся при гриппе, используют три серодиагностические реакции: нейтрализации биологической активности вируса (РН), задержки гемагглютинации (РЗГА) и связывания комплемента (РСК). Каждую пару сывороток исследуют с несколькими штаммами господствующих в данное время разновидностей вирусов А и В, а также вирусом С. РН - наиболее достоверный, но и наиболее трудоемкий и дорогостоящий метод определения сдвига антител. В реакции используют по 100-1000 доз активного вируса, а для определения нейтральности смеси вируса с сывороткой заражают восприимчивых животных (мышей, хорьков), куриные зародыши или культуры их хорион-аллантоисных оболочек.

РЗГА - наиболее простой и достаточно специфичный метод учета сдвига антител у переболевших, используемый чаще других. Для удаления неспецифических ингибиторов, нередко содержащихся в сыворотке крови человека, сыворотки прогревают 30 мин. при t° 50°, а также обрабатывают KJO4, фильтратом холерного вибриона, риванолом или двуокисью углерода. При использовании стандартных ингибиторо-резистентных антигенов обработка ограничивается прогреванием. Смесь 0,2 мл каждого разведения сыворотки и 4 АЕ (агглютинирующих единиц) антигена выдерживают 1 час при комнатной температуре пли 18 часов при t° +4°. Удлиненный контакт антигена и сыворотки особенно полезен для выявления антител к неавидным штаммам господствующей в данное время разновидности вируса гриппа А2. По истечении срока инкубации во все разведения и контроль добавляют по 0,4 мл 1% взвеси эритроцитов кур для обнаружения неингибированного вирусного гемагглютинина. Последнее разведение сыворотки, оказавшее полный ингибирующий эффект, принимают за титр. Вируснейтрализующие антитела и антигемагглютинины обладают не только типовой, но и штаммовой специфичностью; поэтому при использовании для серодиагностики РН и РЗГА может быть определен не только тип, но и штаммовая разновидность вируса, вызвавшего заболевание.

РСК используют лишь в модификациях, предусматривающих длительный (18 час.) контакт антигена и антитела на холоде. Если в качестве антигена используют нативные аллантоисные культуры или S-антигены, то этот тест дает представление лишь о типе вируса, вызвавшего заболевание. При использовании V-антиге. а могут быть выявлены сдвиги антител к отдельным штаммам возбудителя гриппа. При наличии небольших количеств сыворотки и необходимости проведения анализа со многими антигенами применяют микрометоды РСК и РЗГА.

К методам ранней диагностики относится обнаружение гриппозных цитоплазматических включений (рис. 3) методом риноцитоскопии. Ранние методы диагностики основаны на обнаружении специфических изменений или специфического антигена в отделяемом верхних дыхательных путей больного. Слизистую оболочку носа и глотки интенсивно протирают ватным тампоном, эмульгируют его в небольшом количестве физиологического раствора и после центрифугирования делают из осадка мазки, которые фиксируют, окрашивают, просматривают в люминесцентном микроскопе. После окраски акридиновым оранжевым в мазках у больных гриппом находят ярко-красные цитоплазматические включения. После окраски мазков антисыворотками, меченными изотиоцианатом флюоресцеина, в препаратах обнаруживают клетки с ярко-зеленым свечением. Меченые антисыворотки используют для ускоренной диагностики при выявлении вируса гриппа в культурах клеток, зараженных материалом от больных. В этом случае специфическое свечение обнаруживается как в ядре, так и в цитоплазме пораженных клеток. Как правило, готовят несколько препаратов, окрашивают их мечеными антисыворотками к разным типам и разновидностям гриппозных вирусов. Тип вируса, вызвавшего заболевание, определяют по антисыворотке, вызвавшей свечение клеток.

Рис. 3. Отпечатки с нижней носовой раковины. Характерные для гриппа цитоплазматические включения (указаны стрелкой) в клетках цилиндрического эпителия (окраска по Романовскому - Гимзе).

Рис. 3. Отпечатки с нижней носовой раковины. Характерные для гриппа цитоплазматические включения (указаны стрелкой) в клетках цилиндрического эпителия (окраска по Романовскому - Гимзе).

При аденовирусной инфекции свечение наблюдается только при использовании сывороток к аденовирусам, и светящиеся массы располагаются лишь в зоне ядра. При парагриппозных инфекциях парагриппозная сыворотка соответствующего типа вызывает свечение только цитоплазмы клеток.

Л. Закстельская.